水稻隐性雄性不育突变体osnp3的败育特征及基因定位

李翔　杜双林　朱文平　张毅

摘要：在粳稻品种中花11的组培后代中发现了1个无花粉型雄性不育突变体osnp3。该突变体花药细长且呈白色半透明状，花药中无成熟花粉粒，但其株高、有效穗数、穗粒数等农艺性状与野生型中花11无明显差异。花药半薄切片观察表明，突变体osnp3在花药发育过程中其绒毡层细胞延迟降解，小孢子细胞淀粉未充实，最终小孢子细胞退化降解，花药亦不能开裂。用突变体osnp3杂合株后代分离群体研究其遗传规律，表明突变体osnp3受1对隐性核基因控制。利用籼稻明恢63（MH63）与突变体osnp3杂交的F₂定位群体将突变基因定位于第4染色体长臂C04D1、C04D3这2个标记之间，并与标记04008、C04D2共分离，物理距离约为0.96 Mb。测序表明，在定位区间内，1个编号为LOC_Os04g51070的基因第3外显子中插入了约4 kb的逆转座子，导致其功能缺失突变。该基因编码1个含有bHLH结构域的转录因子，推测其通过转录调控参与花药绒毡层细胞的降解；
而其突变后绒毡层细胞未能正常降解，从而引起花粉败育。

关键词：水稻；
隐性雄性不育；
基因定位；
osnp3

中图分类号：S511.035.1文献标志码：A文章编号：1002-1302（2023）11-0106-07

水稻雄性不育是指水稻花药无法产生正常功能的花粉，而其雌性生殖器官功能正常，异花授粉可以正常结实的现象。水稻花药的发育历程极其复杂，小孢子在此阶段经历减数分裂、有丝分裂，雄蕊原基不断分裂分化，形成表皮层、内皮层、中间层、绒毡层，随后又不断降解。有学者对拟南芥花药发育进行详细研究，结合水稻花药发育过程形态变化，对水稻花药发育的时期作了新的14期划分［1-3］。水稻花药在发育的14个时期中，均受到一系列相关基因的精准调控，任何关于小孢子发育的调控基因、减数分裂基因、绒毡层发育调控因子、花粉囊和花粉外壁调控因子、花药开裂调控因子等基因发生突变，均会引起花药发育异常，最终导致水稻雄性不育［4］。

目前已鉴定出大量与水稻雄性不育有关的基因［5］，包括与绒毡层细胞发育和降解相关的基因Undeveloped Tapetum1（UDT1），该基因调节与控制花药最内层绒毡层细胞的基因表达以及花粉母细胞的减数分裂［6］。UTD1突变体的绒毡层在减数分裂期时空泡化，中间层的降解并未正常进行，出现延迟，由此引起性母细胞不能发育成花粉，导致花粉的完全败育。Tapetum Degeneration Retardation（TDR）在绒毡层细胞PCD过程和形成花粉壁过程起到正向调控的作用，其内在机制是直接结合到PCD基因OsCP1和OsC6启动子区，在TDR突变体中，绒毡层细胞核中间层细胞的降解均出现延迟现象，小孢子从四分体中释放后被迅速降解，因此导致雄性不育［7］；
Eternal Tapetum1（EAT1）［8］是作用在TDR的下游，两者共同调节绒毡层的降解与花粉发育。EAT1还可以通过直接调控位于其下游的天冬氨酸蛋白酶基因OsAP25、OsAP37的表达，正向调控绒毡层PCD。Tdr Interacting Protein2（TIP2）通过作用在UDT1、GAMYB的下游和TDR、EAT1的上游，直接调控两者的表达［9-10］。GAMYB4基因通过编码赤霉素诱导的MYB转录因子，调控水稻绒毡层PCD以及花粉发育的过程，同时也影响花粉囊和糊粉层发育过程中淀粉酶的表达［11］。API5（Apoptosis Inhibitor 5）基因通过编码1个动物抗凋亡蛋白的同源蛋白，正向调控绒毡层PCD，API5突变体抑制PCD过程，延迟绒毡层细胞的降解，引起小孢子发育受阻，最终导致花粉败育［12］。Persistent Tapetal Cell1（PTC1）基因通过编码PHD-finger轉录因子，调控绒毡层细胞发育与花粉粒的形成［13］，在花粉发育的第8至第9时期［1］，PTC1基因主要是在绒毡层细胞和小孢子细胞中表达，在ptc1突变体中，绒毡层细胞出现了降解延迟，并且呈炭疽状坏死现象，花粉壁细胞与花粉发育也出现了异常，由此导致典型的花粉败育。OsNP1是通过编码一种葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶，在绒毡层和小孢子中特异表达，调节绒毡层PCD及花粉外壁形成［14］。BayMax1（BM1）［15］、Earlier Degraded Tapetum1（EDT1）［16］、OsALDH2b［17］、Tdr Interacting Protein3（TIP3）［18］、GAMYB5［19］、Microspore and Tapetum Regulator1（MTR1）［20］等一系列相关转录调控基因分别通过直接激活目标基因，或通过彼此之间的间接调节，并同时协同调控共同靶基因的表达等不同方式，直接或者间接调控水稻绒毡层PCD，其隐性突变则会导致绒毡层降解提前或者延迟，最终导致小孢子发育受阻，出现雄性不育。

水稻的雄性不育在杂种优势利用中具有重要的应用价值，我国最早的三系杂交水稻育种技术用核质互作雄性不育创造了不育系和保持系，实现了三系配套［21］；
随后进一步利用光温敏雄性核不育，实现了不育系和保持系的一系两用，创造了两系杂交水稻育种技术［22］，为我国杂交水稻育种作出了贡献。随着分子设计育种的进一步深入，邓兴旺等也进一步提出水稻智能不育分子设计育种——第3代杂交育种技术（G3育种技术）［23-24］，解决了杂交稻育种过程中资源利用率低、育种周期长等瓶颈问题。这样的新型不育系兼具三系法的稳定性和两系法不受恢保关系影响、配组灵活的优点，比三系和二系杂交水稻育种技术又进了一步，使得更多的水稻普通隐性雄性不育材料的有了应用前景。

本研究在粳稻品种中花11组培后代中鉴定出1个无花粉型雄性不育突变体，命名为osnp3，遗传分析表明该性状受1对隐性核不育基因控制。以该突变体为研究对象，进行了花药发育过程的初步观察，并对osnp3基因进行了定位和候选基因分析，旨在深入了解水稻雄配子发育的分子机理，以及为隐性雄性核不育及相关基因在杂交水稻育种中的应用提供种质资源和理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

osnp3是从粳稻品种中花11组培后代中鉴定出的一个无成熟花粉粒的雄性不育突变体。用籼稻明恢63（MH63）与突变体osnp3杂交后产生的F₂代作为定位群体。所有材料于2019—2021年种植在云南省西双版纳傣族自治州景洪市嘎洒镇试验基地，种植和管理同大田生产。

1.2遺传规律分析及基因定位群体的构建

以突变体osnp3杂合株后代作为分离群体，统计表型正常和不育株的分离比例，用于遗传分析。以籼稻明恢63（MH63）作为父本、突变体osnp3作为母本杂交，其F₂代作为定位群体。

1.3花粉碘染观察

开花期，在田间分别随机选取野生型中花11和突变体osnp3植株各3株，每株随机采集主穗中上部3朵颖花，用1.5% I2-KI溶液染色后，在光学显微镜下观察花粉育性。

1.4突变体osnp3花药的半薄切片观察

取野生型中花11和突变体osnp3不同发育时期的颖花，于戊二醛固定液中（3.5%，用0.2 mol/L的PBS配制，PBS最终浓度为0.1 mol/L） 固定；
利用真空泵抽气，缓慢放气，重复至样品全部沉底，然后放入4 ℃冰箱保存备用；
用0.1 mol/L的磷酸缓冲液冲洗，冲洗完成后尽量吸干磷酸缓冲液后再用1%的锇酸固定1～2 h；
0.1 mol/L磷酸缓冲液置换2次，每次10 min左右；
梯度乙醇脱水和无水丙酮脱水；
再用包埋剂和丙酮混合液预包埋浸透2 h，换纯包埋剂渗透2 h，60 ℃恒温箱中烘烤4 d左右。用Leica RM2265半薄切片机横切花药，切片厚度为 3 μm。甲苯胺蓝染色后用Leica DM200光学显微镜观察并拍照记录。

1.5DNA的提取和基因定位

在F₂定位群体中，随机选取15株野生型单株和15株突变体单株，各剪取适量叶片混合，液氮研磨后，CTAB抽提，构建可育基因池和不育基因池；
F₂群体则单株提取。利用实验室预先设计好的137对InDel引物在基因池间筛选多态性标记。对在基因池间呈多态性的标记进行连锁验证，用连锁标记对F₂群体的不育单株进行基因型分析。根据不同连锁标记的交换子数量及分布，结合标记的物理位置确定初步定位区间。

在初步定位的区间内用Premier 5.0软件进一步设计开发InDel标记，对突变基因进行精细定位。所用引物（表1）均由Tiangen生物科技有限公司合成。

PCR扩增采用12.5 μL反应体系：ddH2O  8.875 μL；
Buffer 1.25 μL；
dNTPs 0.25 μL；
Primer 1 μL；
Polymerase 0.125 μL；
模板DNA 1 μL。PCR程序如下：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；
最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，0.1% AgNO3染色，甲醛和NaOH显色。

1.6候选基因分析

用突变体osnp3杂合株后代分离群体作为测序群体，在开花期取可育、不育个体各30株的叶片分别提取DNA，混合成可育基因池、不育基因池，送到天津诺禾致远公司进行基因组重测序。利用IGV分析定位区间内发生突变的位点，在水稻基因组注释计划数据库（http//rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）中进行比对和查阅，以确定目的基因及相关信息。

2结果与分析

2.1突变体osnp3表型分析

突变体osnp3在株高、有效穗、穗粒数等株型性状（图1）和穗部性状较野生型中花11（图2-A、图2-B）无明显差异。野生型中花11的花药饱满呈黄色，而突变体osnp3的花药瘦小呈白色（图2-C至图2-F）。花粉镜检结果显示，野生型中花11的花粉粒全部被I2-KI染成黑色，而突变体osnp3花药无花粉粒释放出来，完全败育 （图2-G、图2-H）。该结果表明，相关基因对重要的农艺性状、花器官形态无明显影响，但对花药形态和花粉发育有严重影响。

通过花药半横切来观察野生型和突变体osnp3在花药发育过程中的差异。将花药发育划分为14个阶段［1］，在第10期之前，野生型和突变体osnp3的花药发育过程无明显差异。在野生型中，第10期（图3-A）绒毡层继续退化，呈山丘状，小孢子液泡变大，呈圆球形；
第11期（图3-B），绒毡层降解成为薄薄一层，附着在内壁上，小孢子呈镰刀型；
在第12期（图3-C），此时已经见不到绒毡层细胞的痕迹，小孢子也因为内部饱含淀粉和脂质等物质而变圆；
在第13、14期，花粉因为营养物质的不断积累而

更充实，花药壁变得更薄，最后花药开裂，完成散粉。而在突变体osnp3中，在第10期（图3-F）的时候能够观察到正常的绒毡层，且与野生型并无明显差异，小孢子发育也正常；
但是在第11期（图3-G），绒毡层并未降解，小孢子发育未见异常；
在第12期（图3-H），绒毡层细胞依然存在，小孢子开始皱缩，在正常情况下，此时的小孢子内部应该充斥淀粉脂质等物质，正是因为绒毡层未能降解，不能为小孢子的成熟提供营养物质及腾出空间，导致在第12期时小孢子的皱缩及随后的降解，也导致第13期（图3-I）和第14期（图3-J）没有成熟的花粉粒。上述观察结果表明，突变体osnp3的花药绒毡层细胞降解异常，小孢子细胞在有丝分裂阶段无法积累淀粉，不能完成花粉充实，小孢子细胞退化，最终不能发育出成熟的花粉粒，导致败育。

2.2突变体osnp3不育性的遗传规律分析

osnp3和野生型的杂交F₁育性正常，F₂育性分离，正常株与不育株的比例经χ2检验，符合3 ∶1（表2），表明正常表型对突变表型为显性，该突变体的雄性不育受一个隐性核基因控制。

2.3目的基因的定位

选取平均分布于12条染色体上的137对InDel标记，在osnp3×MH63的F₂群体可育基因池和不育基因池之间筛选多态性标记，最终在第4染色体（图4-A）上筛选到9对在基因池间呈现多态性的标记04007、04010、0413、0420、0421、0424、0425、0426、0429 （表1）。将4对（0420、0424、0426、04010）在基因池间表现差异的标记用F₂定位群体中的15株可育株与15株不育株进行单株验证，均呈现连锁。用这4个标记对F₂中35株不育株进行群体筛选，标记0420单交换株数为7，双交换株数为2，重组配子数为11；
标记0424单交换株数为4，双交换株数为0，重组配子为4；
标记0426单交换株数为0，双交换株数为0，重组配子数为0；
标记04010单交换株数为3，双交换株数为0，重组配子数为3。其中标记0424的交换株与标记0420完全重合，标记0420与0424交换株与标记04010完全不重合，最终得出该突变位置位于标记0424与04010之间，与标记0426共分离（图4-B）。

在初步定位的区间内用Premier 5.0软件及在Gramene（http：//www.gramene.org）Blast分析，进一步设计开发多态性标记，其中C04D1、C04D2、C04D3、C04D5、04008在亲本（籼稻明恢MH63和突变体osnp3）间呈现多态性。用这5对引物对F₂定位群体中65株不育株进行群体筛选，其中标记C04D1单交换株数为17，双交换株数为1，重组配子数为19；
标记04008单交换株数为0，双交换株数为0，重组配子数为0；
标记C04D2单交换株数为0，双交换株数为0，重组配子数为0；
标记C04D3单交换株数为2，双交换株数为0，重组配子数为2；
标记C04D5单交换株数为21，双交换株数为0，重组配子数为21，且标记C04D3交换株与标记C04D5完全重合，与标记C04D1完全不重合。因此将目标基因定位于标记C04D1和标记C04D3之间，与标记04008和标记C04D2共分离 （图4-C）。

2.4重测序确定候选基因

根据重测序的结果（图5-A），在定位区间内，发现突变体osnp3中，注释基因LOC_Os04g51070第3外显子上有大约4 kb的逆转座子插入（图5-B）。根据以上结果，将LOC_Os04g51070确定为osnp3的候选基因。

根据水稻基因组注释数据库（Rice Genome Annotation Project）提供的水稻基因组注释序列，该候选基因LOC_Os04g51070编码1个bHLH转录因子，可能通过转录调控参与水稻花药绒毡层细胞的降解。此前有报道阐述了EAT1基因编码1个控制绒毡层表达的bHLH转录因子，该报道中的EAT1基因［8］与本研究中的突变基因為同一基因。由于逆转座子的插入导致该基因的功能缺失，从而使绒毡层细胞PCD失败，引起花粉败育。

3讨论

本研究中，突变体osnp3表现出花药瘦小呈白色透明，经I2-KI染色压片后，药室中并未观察到花粉粒，完全败育。花药半薄切片显示突变体osnp3绒毡层细胞降解异常，最终导致小孢子发育失败，形成无花粉型雄性不育。遗传分析和基因定位表明，突变体osnp3由1对隐性核基因控制，位于第4染色体长臂的C04D1、C04D3这2个标记间， 与04008、

C04D2标记共分离，物理距离约为0.96 Mb。经过基因组重测序分析发现，该区域中编码bHLH转录因子基因LOC_Os04g51070的第3外显子有大约 4 kb 的逆转座子插入，最终导致绒毡层细胞PCD失败，由此导致突变体osnp3败育。

本研究中的突变体osnp3是雄性不育基因EAT1＼DTD的一个等位突变体EAT1［8］，EAT1表现为绒毡层细胞的延迟死亡，通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP末端标记（TUNEL）检测和透射电镜（TEM）检测，发现在eat1绒毡层细胞中，直到花药发育第10期，均未观察到明显的DNA碎片信号。在第11期，突变体eat1花药的所有4层均可见微弱的DNA片段信号，提示PCD延迟和异常。本研究的突变体osnp3花药半薄切片发现的败育特征与eat1的败育特征一致。

Ono等的研究表明，EAT1是一种bHLH转录因子，是减数分裂后花药绒毡层程序性细胞死亡（PCD）的关键，其他bHLH蛋白TIP2和UDT1也在这一过程中发挥了重要作用［25］。

水稻隐性核不育对改进水稻种群有积极的作用，利用杂交、回交、测交等育种方法，使优势基因聚集，从而使表型更优良，创造出更具竞争力的杂交水稻品种。本研究以中花11组培后代中的突变体osnp3为对象，观察了其表型及研究了遗传规律，并且利用不育突变体osnp3与MH63杂交衍生的分离群体，成功地将osnp3定位于水稻第4染色体上C04D1、C04D3这2个标记间，与04008、C04D2标记共分离，通过重测序确定了候选基因。下一步需要设计相关引物，通过PCR扩增测序验证，进一步证实可能的插入突变，还需构建互补表达载体验证OsNP3基因的功能等，以进一步了解改基因的功能，旨在为其在杂交稻选育中的利用奠定基础。

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