电针与双歧杆菌对不同性别肥胖大鼠脑肠肽及TNF-α的影响

钱虹宇，颉媛媛，吴小莉，许婧

(成都中医药大学，四川 成都 610075)

近50年以来，全球范围内的肥胖症患者显著增加[1]，其中亚太地区40.9%的成年人患有肥胖症[2]。《中国居民营养与慢性病状况报告(2020年)》中数据显示，17岁以下青少年儿童的肥胖率高达29.4%，成年居民的肥胖率更是超过了50%[3]，肥胖症与性别之间也有着密切联系，有研究发现任何年龄段女性的肥胖率均高于男性[4]。《中国居民肥胖防治专家共识》指出，目前，中国是全球超重和肥胖人数最多的国家[5]，肥胖已成为危害居民健康的严重公共卫生问题。因此，使用安全有效的干预措施来治疗肥胖症已成为国内外研究热点。

前期研究表明，电针与益生菌治疗肥胖症均有较好的临床疗效[6-8]，在《肥胖症中医诊疗方案专家共识》[9]中电针疗法为A级推荐，双歧杆菌作为临床常用的益生菌，研究证实可减少肥胖症患者的体质量[10-11]。近年来，脑肠轴(Brain-gut Axis，GBA)和炎症因子与肥胖症之间的联系引起了研究者的关注。GBA是大脑和胃肠道之间双向调节的复杂神经体液通信网络，GBA可导致男性与女性在整个生命期能量和营养需求方面表现出不同的模式，因此性别差异在GBA调控肥胖症过程中可能是一个重要的因素[12]。脑肠肽(Brain-gut Peptide，BGP)是GBA各通路的物质基础和作用靶点，分布于中枢神经系统和胃肠道，具有激素和神经递质的双重性质。现有研究表明，BGP中的肽YY(Peptide YY，PYY)、胆囊收缩素(Cholecystokinin，CCK)、胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like Peptide -1，GLP-1)和生长激素释放肽(Growth Hormone Releasing Peptide，Ghrelin)与肥胖症密切相关[13]。与此同时，肥胖人群还呈现出促炎与抗炎免疫细胞失衡的慢性炎症状态。因此，慢性炎症反应也是肥胖症的标志之一。研究表明，肥胖症与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)之间也有着密切联系[14]。电针与双歧杆菌治疗肥胖症均安全有效，但其在BGP和炎症因子与性别差异中的作用机制还未完全阐明。因此，本研究提出电针与双歧杆菌可能通过影响血清中PYY、CCK、GLP-1、Ghrelin和TNF-α的水平，达到治疗肥胖症的目的，并且这种影响在性别中可能存在差异。本研究通过观察电针、双歧杆菌、电针+双歧杆菌不同干预措施对不同性别肥胖大鼠的体质量、Lee’s指数、摄食量及血清中PYY、CCK、GLP-1、Ghrelin和TNF-α的水平的影响，探讨电针与双歧杆菌治疗肥胖症在BGP和炎症因子中的作用机制，为临床治疗肥胖症提供更多的理论依据。

1.1 实验动物

采用4周龄SPF级SD大鼠60只(雌雄各30只)，体质量在60-80 g范围内，实验动物由成都达硕实验动物有限公司提供【SCXK(川)2015-030】。饲养于成都中医药大学SPF级实验动物中心【SYXK(川)2019-049】，喂养条件昼夜节律与湿度恒定，室温(23±3)℃。动物购入后适应性喂养一周，期间普通饲料喂养，摄食饮水自由。

1.2 试剂

PYY、GLP-1、GHRH ELISA试剂盒(Elabscience公司，批号分别是XfiE2sd2HV、DMLFPD4414、TGK1867T8Q；
货号分别是E-EL-R0720c、E-EL-R3007、E-EL-R2856c，中国)，CCK ELISA试剂盒(酶免实业有限公司，货号：MM-0034R1，中国)，TNF-α ELISA试剂盒(Elabscience公司，批号：9hSfs5QL06；
货号：E-EL-R2856c，中国)，双歧杆菌三联活菌肠溶胶囊(晋城海斯制药有限公司，中国)。

1.3 仪器

华佗牌0.25 mm×25 mm的一次性无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司，中国)；
SDZ-Ⅴ型电针仪(苏州医疗用品厂有限公司，中国)；
台式高速微量离心机(赛洛捷克SCILOGEX公司，型号：D3024，美国)；
台式高速冷冻离心机(赛洛捷克SCILOGEX公司，型号：D3024R，美国)；
高速低温组织研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司，型号：KZ-III-F，中国)；
光谱仪(伯腾BioTek公司，型号：μQuant，美国)。

2.1 高脂饲料诱导肥胖模型建立及分组

适应性喂养结束后，将60只(雌雄各30只)SD大鼠随机分为两组，A组8只(雌雄各4只)，造模组52只(雌雄各26只)，分别给予普通饲料、高脂饲料喂养，均自由摄食饮水，建立食源性肥胖动物模型。造模成功标准为造模组大鼠体质量超出同期空白组大鼠平均体质量的20%。6周后，雄性大鼠造模成功16只，8周后，雌性大鼠造模成功16只。共32只大鼠造模成功，平均随机分为M组、E组、B组和E+B组，每组8只(雌雄各4只)。

2.2 干预方法

A组:大鼠采用自制固定器固定30 min,1次/d,连续6 d，休息1 d，共4周。其余不做任何其他处理，给予普通饲料喂养。M组：与空白组操作处理方法相同，给予高脂饲料喂养。E组：大鼠固定后，参考《实验针灸学》[13]选择“天枢”穴和“丰隆”穴。将针灸针刺入3-5 mm，先以平补平泻法行针约1 min后，连接SDZ-Ⅴ型电针治疗仪，选用频率为3 Hz-8 Hz，强度为0.5-1 mA的疏密波，观察大鼠下肢及针柄变化，以轻微节律抽搐为度，留针30 min，1次/d，连续6 d，休息1 d，共4周，左右两侧穴位交替使用，给予高脂饲料喂养。B组：双歧杆菌用量为0.7 g/kg，用9%生理盐水配制成浓度为100 g/mL的溶液进行灌胃，1次/d，连续6 d，休息1d，共4周，灌胃前将大鼠固定30 min，给予高脂饲料喂养。E+B组：电针操作方法与E组相同，电针治疗结束后，给予双歧杆菌溶液灌胃，与B组灌胃方法相同。1次/d，连续6 d，休息1 d，共4周，给予高脂饲料喂养。

2.3 一般指标

2.3.1 体质量、Lee’s指数

2.3.2 摄食量

摄食量每天进行测量，摄食量=起始量-剩余量。

2.4 样本采集

治疗第28 d结束后，所有大鼠禁食不禁水12 h，第29天清晨测量并记录所有大鼠体质量。大鼠麻醉后，腹主动脉采血5 mL，置于一次性负压采血管内，2 000 rpm，离心半径6 cm，离心10 min，取上层血清，放置于-80℃冰箱避光保存。

2.5 ELISA检测

将放置于-80℃保存的血清取出，严格按照ELISA说明书要求检测血清样本中PYY、CCK、GLP-1、Ghrelin和TNF-α水平。

2.6 数据统计分析

3.1 造模期间大鼠体质量、Lee’s指数变化情况

造模前，两组大鼠的体质量和Lee’s指数均无差异(P>0.05)，分别给予两组大鼠普通饲料、高脂饲料喂养。造模后，高脂饲料组大鼠的平均体质量和Lee’s指数均显著高于普通饲料组(P<0.05)。表明高脂饲料诱导的肥胖大鼠模型造模成功。见表1-2。

3.2 电针与双歧杆菌对肥胖大鼠体质量、Lee’s指数影响

干预治疗后，与M组比较，E组、B组与E+B组雌性大鼠的体质量均明显减少(P<0.05)，雄性大鼠的体质量显著减少(P<0.01)；
与M组比较，E组、B组与E+B组雌性大鼠的Lee’s指数无显著差异(P>0.05)；
与M组比较，E组雄性大鼠的Lee’s指数明显降低(P<0.05)，B组与E+B组雄性大鼠的Lee’s指数显著降低(P<0.01)。见表3、图1。

表3 各组大鼠干预后体质量与Lee’s指数比较

注:与M组相比,◇P<0.01,◆P<0.05

3.3 电针与双歧杆菌对肥胖大鼠摄食量的影响

干预治疗后，与M组比较，E组雄性大鼠与雌性大鼠的摄食量均明显减少(P<0.05)，B组雄性大鼠与雌性大鼠的摄食量均显著减少(P<0.01)，E+B组雄性大鼠的摄食量明显减少(P<0.05)、雌性大鼠的摄食量显著减少(P<0.01)；
与E组比较，E+B组雌性大鼠的摄食量显著减少(P<0.01)。摄食量的减少与性别之间存在一定的相关性(P<0.05)。见图2。

注:与M组相比,▲P<0.05,●P<0.01;与E组相比,★P<0.05

3.4 电针与双歧杆菌对肥胖大鼠血清中PYY、CCK、GLP-1和Ghrelin水平的影响

干预治疗后，与A组比较，M组雄性大鼠与雌性大鼠血清中PYY、CCK、GLP-1和Ghrelin水平均显著下降(P<0.01)，表明肥胖大鼠血清中PYY、CCK、GLP-1和Ghrelin水平均低于正常大鼠。干预治疗后，血清中PYY水平：与M组比较，E组雄性大鼠与雌性大鼠血清中PYY水平均明显升高(P<0.05)，B组和E+B组雄性大鼠与雌性大鼠血清中PYY水平均显著升高(P<0.01)；
与E组相比，B组和E+B组雄性大鼠血清中PYY水平均明显升高(P<0.05)，B组和E+B组雌性大鼠血清中PYY水平均显著升高(P<0.01)。血清中CCK水平：与M组比较，B组和E+B组雄性大鼠血清中CCK水平均明显升高(P<0.05)，B组、E+B组雌性大鼠和E组雄性大鼠与雌性大鼠血清中CCK水平均显著升高(P<0.01)；
与B组和E+B组比较，E组雄性大鼠血清中CCK水平明显升高(P<0.05)，E组雌性大鼠血清中CCK水平显著升高(P<0.01)。血清中GLP-1水平：与M组比较，E组雄性大鼠血清中GLP-1水平明显升高(P<0.05)，E组雌性大鼠、B组和E+B组雄性大鼠与雌性大鼠血清中GLP-1水平均显著升高(P<0.01)；
与E组和E+B组比较，B组雄性大鼠与雌性大鼠血清中GLP-1水平均显著升高(P<0.01)。血清中Ghrelin水平：与M组比较，E组、B组和E+B组雄性大鼠与雌性大鼠血清中Ghrelin水平均显著升高(P<0.01)；
与E组和E+B组比较，B组雄性大鼠与雌性大鼠血清中Ghrelin水平均显著升高(P<0.01)。见图3-6。

注:与A组相比,##P<0.01;与M组相比,▲P<0.05,●P<0.01;与E组相比,★P<0.05,#P<0.01

注:CCK水平为样品稀释5倍后结果。与A组相比,##P<0.01;与M组相比,▲P<0.05,●P<0.01;与B组和E+B组相比,★P<0.05,#P<0.01

注:与A组相比,##P<0.01;与M组相比,▲P<0.05,●P<0.01;与E组和E+B组相比,#P<0.01

注:与A组相比,##P<0.01;与M组相比,●P<0.01;与E组和E+B组相比,#P<0.01

3.5 电针与双歧杆菌对肥胖大鼠血清中TNF-α的影响

干预治疗后，与A组比较，M组的雄性大鼠与雌性大鼠血清中TNF-α的水平显著升高(P<0.01)，表明肥胖大鼠血清TNF-α水平高于正常大鼠。干预治疗后，与M组和B组比较，E组和E+B组雄性大鼠与雌性大鼠血清中TNF-α水平均显著降低(P<0.01)，M组和B组之间差异无统计学意义(P>0.05)。见图7。

注:与A组相比,##P<0.01;与M组和B组相比,●P<0.01

中医认为肥胖的病机属“阳气虚衰、痰湿偏盛”，为本虚标实之病症，病位主要在脾胃。“天枢”穴和“丰隆”穴均属于足阳明胃经，“天枢”穴是大肠的募穴，具有通调肠腑、增强大肠传化糟粕的功能，“丰隆”穴是胃经的络穴，属阳而络阴，“一络而通二经”可通脾胃两经之气血。并且“丰隆”穴为化痰奇穴，针对“肥人多痰湿”的特点有明确疗效。“天枢”穴与“丰隆”穴均为临床治疗肥胖症常用穴位[15]。故本实验选用“天枢”穴和“丰隆”穴。

脑肠肽是双重分布于脑组织和胃肠道中的调节肽[16]，脑肠肽可通过不同的信号通路，调节食欲和能量消耗之间的平衡[13]。与肥胖症密切相关的BGP中，PYY、CCK、GLP-1为抑食欲肽，Ghrelin则为促食欲肽，均与摄食量有着密切联系。当PYY、CCK和GLP-1水平升高时，产生饱腹感，肠道转运速率减慢，延长食物在胃肠道停留和胃排空的时间，从而抑制食物的摄入[13，17-18]。Ghrelin主要由胃组织泌酸腺的X/A样细胞分泌，作用于下丘脑弓状核，使胃肠动力增强，从而促进食物的摄入[13]。本实验结果显示，与A组比较，M组雄性大鼠与雌性大鼠血清中PYY、CCK、GLP-1和Ghrelin水平均显著下降(P<0.01)，血清中Ghrelin水平显著下降，原因可能是肥胖大鼠体内存在胰岛素抵抗，由于肥胖增加了空腹胰岛素水平，胰岛素对Ghrelin分泌产生了抑制作用，这与吴曼婷[19]的研究结果一致。侯梦等[20]研究结果显示在3-15岁儿童中，肥胖症患者Ghrelin的水平显著高于正常组，韩江等[21]研究结果也显示肥胖大鼠的Ghrelin水平高于正常组，这与本实验的研究结果相反，还需进一步深入研究。肥胖症患者还表现为白色脂肪组织增加，白色脂肪组织扩张，导致脂肪组织处于缺氧状态从而凋亡，引发巨噬细胞聚集从而使肥胖相关的炎症因子水平升高[22]。研究表明肥胖模型动物的脂肪组织中促炎因子TNF-α的表达与脂肪细胞数量存在正相关，肥胖症可引起TNF-α水平升高[14，22]，本实验结果也为M组雄性大鼠与雌性大鼠血清中TNF-α的水平显著升高(P<0.01)。

日本一项基于277名20-89岁健康受试者的研究表明，肠道菌群的变化与年龄和性别均有关[23]。目前研究证实，肠道菌群在性别方面存在差异[24-26]。本实验在使用高脂饮食诱导肥胖大鼠模型时，雄性大鼠所需时间短于雌性大鼠，这与前期研究发现雌性大鼠对高脂饮食的敏感性低于雄性大鼠具有一致性，导致敏感性区别的机制可能是性别所导致的肠道菌群差异[27]，肠道菌群又与大脑密切相关。因此，性别也是GBA调控肥胖症作用机制中重要的因素之一。本实验结果显示，电针、双歧杆菌和电针+双歧杆菌均能通过对脑肠肽的调节，抑制摄食量，并且电针和电针+双歧杆菌还可通过对抑制TNF-α的表达，达到治疗肥胖症的目的。但在性别方面存在差异，雄性大鼠的体质量与Lee’s指数均下降，雌性大鼠的体质量下降，但Lee’s指数无明显差异，对雄性大鼠的疗效略优于雌性大鼠。与黄迪迪[28]和高飞[29]的研究结果一致，针灸治疗肥胖症患者时，男性患者在降低体质量指数方面优于女性患者。但一项双盲、安慰剂对照的随机试验中，鼠李糖乳杆菌对女性体质量和脂肪量减少程度均优于男性[30]。这与本实验的结果相反，这可能与使用的益生菌种类有关。通过电针、双歧杆菌、电针+双歧杆菌治疗后，雄性大鼠与雌性大鼠清中PYY、CCK、GLP-1和Ghrelin水平均升高，性别之间没有差异。电针对血清中CCK水平的影响最为显著，双歧杆菌对血清中GLP-1与Ghrelin水平的影响最为显著，双歧杆菌与电针+双歧杆菌对血清中PYY水平的影响高于电针。经电针与电针+双歧杆菌治疗后，TNF-α的水平明显降低，但双歧杆菌对TNF-α的水平没有影响，性别之间没有区别，陈桥桥[31]和周钰点[32]的研究结果也表明电针可降低TNF-α水平。最终体现在摄食量方面，E组、B组、E+B菌组中雄性大鼠与雌性大鼠的摄食量均减少，并且B组雄性大鼠与E+B组雌性大鼠的摄食量减少最为显著，摄食量减少程度与性别之间存在一定的相关性。

综上所述，电针与双歧杆菌均可有效降低肥胖大鼠的体质量，在性别上存在一定的差异，雄性大鼠的疗效略优于雌性大鼠。其作用机制可能与电针与双歧杆菌均能升高血清中PYY、CCK、GLP-1和Ghrelin水平，电针降低TNF-α水平相关，通过BGP抑制食欲和炎症因子表达，减少摄入量并降低炎症水平，最终达到治疗肥胖症的目的，为临床治疗肥胖症提供了理论基础。

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