补肾活血方治疗特发性肺间质纤维化的网络药理学研究与实验验证

吕 鹏 李 芮 刘晓明

(1 山东中医药大学,济南,250014; 2 山东中医药大学附属医院,济南,250014)

特发性肺间质纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是不明原因导致的肺间质病变致使肺功能迅速恶化,并最终发展为呼吸衰竭甚至死亡[1-2],其发病机制尚未完全明确,主要病理因素涉及肺上皮细胞损伤、上皮-间质转化发生、成纤维细胞增殖、血管新生与重塑等多种过程[3-4]。关于IPF的治疗,目前证明切实有效的治疗方案不多。2022年由美国胸科学会(American Thoracic Society,ATS)、欧洲呼吸学会(European Respiratory Society,ERS)、日本呼吸学会(Japanese Respiratory Society,JRS)共同颁布的最新指南提出IPF的治疗包括药物如尼达尼布和吡非尼酮和非药物如补充氧气和(或)肺康复2种治疗方案[5]。除吡非尼酮、尼达尼布有条件推荐使用外,此前治疗方案中的大部分药物因为疗效不明显且不良反应大,均被列为有条件不推荐使用或强烈不推荐使用范围[5-6]。因此,发挥中医药的优势,探索验方补肾活血方延缓IPF进展的分子机制,对下一步开发新药,解决世界性的纤维化治疗难题具有重要意义。

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞 10周龄健康新西兰兔10只,体质量2.5～3 kg,购自济南西岭羊角养殖繁育中心,动物许可证号:SCXK(鲁)20150001。山东中医药大学附属医院实验动物伦理委员会审核通过了实验流程(伦理审批号:AWE-2019-056)。饲养条件:室温22～25 ℃、湿度40%～60%和12 h黑暗与光照交替的环境及正常饮食。在实验开始前进行5 d的适应性喂养。人胚肺成纤维细胞MRC-5(南京凯基生物科技发展有限公司,货号:KG508)培养于山东中医药大学附属医院细胞实验室。使用含10%的胎牛血清的不完全杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle Medium,DMEM),放入5%CO2、37 ℃培养箱中培养MRC-5细胞,当培养瓶内细胞生长达80%左右时,用胰酶消化传代,选择第3～4代细胞用于实验。

1.1.2 药物 补肾活血方:人参9 g、熟地黄15 g、黄芪30 g、虎杖12 g、山茱萸9 g、丹参15 g、当归15 g、川贝母6 g、五味子6 g、黄芩12 g、麦冬15 g、炙甘草6 g。购自山东中医药大学附属医院,产品质量符合《中华人民共和国药典》(2020年版)标准。

1.1.3 试剂与仪器 MEM培养基(GIBCO,美国,货号:11095080);胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(GIBCO,美国,货号:10099141);转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)(上海皓元生物医药科技有限公司,货号:HY-P7118);二甲亚砜[阿拉丁试剂(上海)有限公司,货号:B1328005];1640培养液(GIBCO,美国,货号:1171219)。超净工作台(苏州净化,型号:SW-CJ-IFD);二氧化碳恒温培养箱(SANYO,日本,型号:MCO-18AC);水平电泳仪(上海天能科技有限公司,型号:EPS-300);蛋白转膜仪(上海天能科技有限公司,型号:VE-186);蛋白电泳仪(上海天能科技有限公司,型号:VE-180)。

1.2 方法

1.2.1 补肾活血方成分及其靶点的获取 补肾活血方中共有12味中药,分别是人参、黄芪、熟地黄、山茱萸、麦冬、五味子、当归、丹参、黄芩、川贝母、虎杖、炙甘草,其所含化合物可视为补肾活血方的成分。本研究依据指南从草药成分靶点数据库(Herbal Ingredients′ Targets Database,HIT)(http://lifecenter.biosino.org/hit/)、中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)、网络药理学在线数据库(Traditional Chinese Medicines Integrated Database,TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid)3个数据库及文献检索中收集到645个化合物[7]。在此基础上,运用化合物相互作用搜索工具(Search Tool for Interacting Chemicals,STITCH)数据库(http://stitch.embl.de/)检索上述化合物的靶点,最终检索到524个化合物和2 904个靶点之间形成了126 549个互作关系。

1.2.2 IPF相关疾病基因获取 基于先前的临床观察及实验研究,发现补肾活血方对治疗IPF效果显著[8]。本研究从MalaCards人类疾病数据库(The Human Disease Database)(https://www.malacards.org/)中获得IPF的疾病标准ID:PLM134,并收集到IPF相关基因162个。

1.2.3 批准的IPF药物标靶获取 美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的治疗IPF的药物有2种,分别是吡非尼酮和尼达尼布。本研究从DRUGBANK数据库(https://drugbank.com/)中分别提取2种药物的相关靶点。其中吡非尼酮相关靶点5个,尼达尼布相关靶点21个。

1.2.4 补肾活血方的活性成分筛选 补肾活血方是口服给药,其发挥药效受药物“吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代谢(Metabolism)和外排(Excretion)(ADME)特性的限制,ADME值低,往往意味着药物不能在相应靶点发挥良好的药效反应,而药物ADME的性质常常可以通过类药性指数(Quantitative Estimate of Drug-likeness,QED)反映[9]。该指标整合了8个被普遍认为对类药性分析相对重要的分子描述符:1)分子质量;2)氢键供体(Hydrogen Bond Donor,HBD)的数量;3)辛醇-水分配系数(Octanol-Water Partition Coefficien,AlogP);4)氢键受体(Hydrogen Bond Acceptor,HBA)的数量;5)旋转键(Rotatable Bond,ROTB)的数量;6)芳环(AROM)的数量;7)分子的极性表面积(Polar Surface Area,PSA);8)结构警报的数量。一般认为,QED值越大类药性越好,参考相关研究[10],将QED值设定为0.4以筛选出补肾活血方的活性成分。

1.2.5 补肾活血方的核心靶点筛选 首先运用基于网络节点距离和路径的重启随机游走算法(Random Walk with Restart,RWR)方法评价补肾活血方靶点与IPF疾病基因之间的相关性[11-12]。利用STITCH数据库中的药靶关联性阈值对获取的2 904个靶点进行筛选[13],该阈值设定为>400[14]。基于以上结果,按照二项分布理论计算靶点与k个以上活性成分具有相互作用的概率P(X≥k)[15],P越小筛到的靶点越重要,设P<0.001。最后,将获取的上述靶点与IPF相关基因结果分别去重后取交集,得到补肾活血方的核心靶点。

1.2.6 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建 在String数据库(https://www.string-db.org/)中输入核心靶点,得到靶点之间的相互作用关系,同时导出PNG格式和TSV格式。将TSV格式中Node1和Node2数据导入Cytoscape 3.8.1软件,构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)网络。将活性成分-靶点.xlsx文件和中药-活性成分-靶点.xlsx文件分别导入Cytoscape 3.8.1软件,构建网络,预测出补肾活血方治疗IPF的活性成分-靶点和中药-活性成分-靶点的网络关系图,利用Network Analyzer插件进行网络拓扑属性分析,在该网络中,圆的大小(Size)、透明度(Transparency)及标签字号(Label Font Size)均根据Degree值定义。Degree值越高表明该靶点的作用越关键,与该节点的连线越多。边的粗细(Width)、透明度(Transparency)均根据Combined Score值定义。Combined Score值越高,表明2个靶点之间的相互作用越强,该节点起到的作用越为关键。其中,绿色圆形图标代表的是核心靶点,黄色菱形图标分别代表12味中药,方形图标代表中药的活性成分,其中围绕中药的方形图标是其独特的活性成分,蓝色方形图标代表的是某几种中药共有的活性成分。中药以各自首字母缩写为标签,如“黄芪”的标签是“HQ”,因“黄芪”与“黄芩”首字母缩写相同,故定义黄芩的标签为“HQIN”。为标准化活性成分名称,更清晰地用网络图表现互作关系,本研究中的所用活性成分均转化为PubChem CID号。

1.2.7 补肾活血方治疗IPF核心靶点的基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 运用基因列表注释和分析网站(Metascape)数据库(https://metascape.org/),导入补肾活血方治疗IPF的50个核心靶点,GO富集分析和KEGG富集分析,限定物种为“homo sapiens”,筛选P<0.05的条目,最终富集结果包括:生物过程(Bioligical Process,BP)、细胞组分(Cellular Component,CC)、分子功能(Mokecular Function,MF)相关过程。对富集排名靠前的20个条目作图,并把核心靶点投射到KEGG通路图中以预测补肾活血方治疗IPF的分子机制。

1.2.8 分子对接分析 分子对接主要用于蛋白质和小分子的结构对接,并评估小分子与蛋白质结合位点的亲和力。若对接的Affinity值为负值,则提示小分子和蛋白质的结合是自主有效的[16]。本研究在PDB数据库(https://www.rcsb.org/)中对排名前10的靶基因胱天蛋白酶3(Caspase 3,CASP3)、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、Jun激酶(Jun Kinase,JNK)、肿瘤蛋白p53(Tumor Protein P53,TP53)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(AKT Serine/Threonine Kinase 1,AKT1)、促分裂原活化的蛋白激酶3(Mitogen-Activated Protein Kinase 3,MAPK3)、C-X-C基序趋化因子配体8(C-X-C Motif Chemokine Ligand 8,CXCL8)、基质金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9,MMP9)、白细胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)、细胞间黏附分子(Intercellular Adhesion Molecule,ICAM)与补肾活血方中GED值排名靠前的活性成分进行分子对接验证。首先,查找合适的蛋白构象并准备PDB文件,查找的基本原则[17]如下:1)来源于人(Homo Sapiens)的蛋白结构;2)构象分辨率一般在2.5 Å以内,尽可能清晰;3)蛋白质构象序列要尽量完整,结构复合体中必须要有小分子配体信息;4)结晶pH值应尽量接近人体正常生理范围;然后,运用TCMSP数据库准备相应活性成分的结构图,以mol2格式保存;最后将二者导入采用AutoDock Vina软件,加氢,去水,进行分子对接。根据对接结果,选择Affinity为负值且均方根差(Root Mean Square Deviation,RMSD)分值<2[18]的利用PyMol 2.5.2软件进行可视化分析。

1.2.9 补肾活血方与批准药物共同靶点的KEGG富集分析与分子对接 本研究对共同靶点进行了KEGG富集分析,并通过PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)对IPF的分子机制进行文献检索,将共同靶点中的血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、血小板衍生生长因子(Platele Derived Growth Factor,PDGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)的受体以及Lyn原癌基因(LYN Proto-Oncogene,LYN)、细胞色素P450家族3亚家族A成员4(Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A Member 4，CYP3A4)确定为本研究的关键靶点，将关键靶点与补肾活血方中对应的QED值和药靶相关性较高的活性化合物进行分子对接。同时将吡非尼酮、尼达尼布与各自对应的关键靶点进行分子对接，对每次对接进行打分。

1.2.10 含药(补肾活血方)血清制备 补肾活血方中药汤药制备:根据人的用药量,结合人和动物体表面积折算的等效剂量比值表分别计算。将8倍新西兰兔等效剂量的中药准确称取,加入8倍量的水浸泡后煎煮,水沸后小火煎煮约30 min后滤出药液;然后,再次加入6倍量的水继续煎煮20 min滤出药液。将2次药液合并后过滤浓缩,浓度为3 g/mL,置4 ℃冰箱保存备用。

制备过程:健康新西兰兔按照随机数字表法分为含药血清组和正常血清组。给予8倍新西兰兔等效剂量的中药灌胃,给药量为56 g/kg(生药量),灌胃前禁食不禁水12 h,1次/d,连续给药7 d后,第7天灌胃1次,给足1 d剂量。末次给药后1 h在家兔自然清醒状态下,以1%利多卡因5 mL腹腔内注射麻后从腹主动脉采血。血液于37 ℃下静置1 h,待凝血后以5 000 r/min,离心半径8 cm,离心10 min,常规分离血清,并将同组家兔的血清合并,56 ℃水浴30 min灭活补体,用0.22 μm醋酸纤维素膜过滤除菌,-20 ℃保存备用。正常血清组:以生理盐水灌胃,相同方法采血制备血清。

1.2.11 MTT法筛选含药(补肾活血方)血清的最佳血药浓度 将细胞随机分为正常组(正常DMEM培养基)及不同稀释浓度(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)含药血清干预组等9组,每组8个复孔。置于37 ℃ 5%CO2培养箱中,于培养24 h后,吸弃培养液,培养板每孔加入20 μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐液(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT),培养箱中孵育4 h后,吸取MTT液,加入DMSO,振荡摇匀后在避光孵育15 min,选择波长490 nm处,酶标仪读取各孔OD值并记录。统计每组OD值,每组实验重复操作3次。

1.2.12 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测含药血清对人胚肺成纤维细胞增殖及增殖抑制率的影响 增殖抑制率(%)=(1-观察组OD值/对照组OD值)×100%。将人胚肺成纤维细胞以1×105/孔接种于96孔板,培养24 h,空白对照组,TGF-β1处理组,TGF-β1处理+最佳浓度含药血清干预1 h组(含药血清组)分别加入不同溶液,空白对照组加入等量PBS溶液,作用24 h,吸去上清,除空白对照组外,每孔加入TGF-β1继续培养48 h。然后将对应孔更换100 μL新的培养基,分别加入10%的CCK-8,放入培养箱中继续培养,4 h后取出,放入酶标仪中,450 nm测OD值。

1.2.13 蛋白质印迹法(Western Blotting)检测1型胶原(Type I Collagen,COL-Ⅰ)、IL-17A、轻链3Ⅱ(Light Chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)(膜型自噬体)含量的变化 抽提总蛋白,具体操作按试剂盒说明进行。最后放入凝胶成像仪中显影。

2.1 补肾活血方活性成分及核心靶点 在获取的524个化合物经过如前所述的筛选之后,最终有201个的补肾活血方的化合物和对应的470个靶点被保留下来用于后续的分析。上述470个靶点与IPF疾病基因取交集,此时得到的靶点即为本研究中补肾活血方的50个交集靶点。见图1。50个交集靶点分别是TGFB1、CCL2、CXCL8、CXCL5、IL-13、IL-1B、CXCR3、IFNG、EDN1、CXCL9、MMP9、CXCL12、TIMP1、CCR4、MMP1、CXCR2、CXCL10、CCR6、VCAM1、CXCR1、CXCL1、FN1、CCR7、TNF、AGT、COL1A1、IL-6、LPAR1、VEGFA、SERPINE1、ALOX5、CTNNB1、AKT1、IL-10、ACTB、ALB、CXCR4、CCR2、AGTR2、STAT3、TP53、TLR4、JNK、HIF1A、MMP2、MPO、MAPK3、ICAM1、PPARG、CASP3。另外,交集靶点所对应的补肾活血方活性成分共118个。

图1 补肾活血方与IPF交集靶点示意图

2.2 基于网络的靶点相关性分析 分别计算Original Average Score和Random Average Score,这个过程被独立重复了500次,P<0.01。见表1。

表1 基于网络的靶点相关性分析结果

2.3 补肾活血方治疗IPF的核心靶点网络图 Degree值较高的核心靶点有CASP3、TNF、JNK、TP53、AKT1、MAPK3、IL-6、MMP9和CXCL8等。见图2。

图2 核心靶点网络

2.4 补肾活血方治疗IPF的活性成分-核心靶点网络 通过前述筛选,共有118种补肾活血方的活性成分对应50个核心靶点。见图3。活性成分-核心靶点网络中,有168个节点,801条作用关系。拓扑分析结果显示,白藜芦醇(CID445154)具有最多的潜在靶点,有62个;其次是槲皮素(CID5280343)和腺苷(CID60961),分别含有35个潜在靶点和32个潜在靶点。从蛋白靶点的角度分析,Degree值较高的靶点有:CASP3、TNF、JNK、TP53、AKT1、MAPK3、IL-6、MMP9、CXCL8、PPARG等。其中CASP3和TNF分别与58个化合物、43个化合物存在相互作用。

图3 活性成分-核心靶点网络

2.5 补肾活血方治疗IPF的中药-活性成分-核心靶点网络 中药-活性成分-核心靶点网络中包含198个节点,1 325条作用关系。见图4。为了更好地表征中药、活性成分与核心靶点的关系,分别在表2和表3中展示出了共有活性成分在补肾活血方中的分布以及活性成分和核心靶点在补肾活血方中的分布。其中,补肾活血方中的共有活性成分共有39种,以补肾药山茱萸中分布的各种活性成分和核心靶点最多,其次为益气活血药,如黄芪、人参、当归、丹参、虎杖等,再次是敛阴润肺止咳药,如人参、麦冬、川贝、五味子等。诸药配伍,加强共有活性成分及核心靶点发挥作用。

表2 共有活性成分在补肾活血方中的分布

表3 活性成分和核心靶点在补肾活血方中的分布(个)

图4 中药-活性成分-核心靶点网络

2.6 核心靶点GO分析和KEGG分析结果 GO分析结果显示共有1 464个BP,27个CC和60个MF相关过程。其中涉及BP富集排名靠前的有:运动的正向调节、白细胞迁移、细胞成分的正向调节、转移、细胞运动的正向调节、细胞迁移的正向调节、细胞因子介导的信号转导通路、血管发育、趋化性、反射运动等。涉及CC富集排名靠前的有:薄膜侧面、质膜外侧、细胞外基质、外封装结构、含胶原蛋白的细胞外基质、分泌颗粒管腔、胞质小泡腔、水泡腔、内质网腔、血小板α颗粒管腔区等。涉及MF富集排名靠前的有:信号受体调节活性、细胞因子受体结合、受体配体活动、信号受体激活物的活性、细胞因子活性、G蛋白耦联受体结合、趋化因子受体结合、G蛋白耦联肽受体活性、肽受体活性、生长因子活性等。见图5。KEGG分析结果显示P<0.05的富集排名前20位的条目进行可视化展示,包括:细胞因子-细胞因子受体相互作用、糖尿病患者年龄-RAGE信号通路的研究并发症、癌症中的通路、趋化因子信号通路、蛋白多糖与癌症、IL-17信号通路、类风湿性关节炎、肿瘤坏死因子信号通路、流体切应力与动脉粥样硬化、甲型流感等。见图6。

图5 核心靶点GO分析(TOP10)

图6 核心靶点的KEGG分析

2.7 补肾活血方活性成分与核心靶点分子对接 结果显示与CASP3蛋白构象稳定的小分子有:黄芩黄酮1,结合能为-6.6 kcal/mol(1 kcal/mol=4.184 kJ/mol),RMSD=1.4 Å。与TNF蛋白构象稳定的小分子有:汉黄芩素,结合能为-9.4 kcal/mol,RMSD=0.7 Å。与JNK蛋白构象稳定的小分子有:千层纸素,结合能为-9.3 kcal/mol,RMSD=0.8 Å。与TP53蛋白构象稳定的小分子有:汉黄芩素,结合能为-7.5 kcal/mol,RMSD=1.1Å。与AKT1蛋白构象稳定的小分子有:汉黄芩素,结合能为-9.3 kcal/mol,RMSD=0.9 Å。与MAPK3蛋白构象稳定的小分子有:二氢木蝴蝶素A,结合能为-8.3 kcal/mol,RMSD=0.8 Å。与IL-6蛋白构象稳定的小分子有:千层纸素,结合能为-5.9 kcal/mol,RMSD=0.5 Å。与MMP9蛋白构象稳定的小分子有:汉黄芩素,结合能为-9 kcal/mol,RMSD=1.1 Å。与ICAM1蛋白构象稳定的小分子有:大豆苷元,结合能为-8.4 kcal/mol,RMSD=0.5 Å。以结合能对构象的稳定性进行排序,得到前3位的对接模式。见图7。

图7 补肾活血方活性成分与核心靶点分子对接模式注:A.汉黄芩素-TNF(PDBID:5wjj);B.千层纸素-JNK(PDBID:4EBV);C.汉黄芩素-AKT1(PDBID:4ENJ)

2.8 基于KEGG富集分析与分子对接比较补肾活血方与批准药物 尼达尼布和吡非尼酮的相关靶点与补肾活血方相关靶点交集包括血管内皮生长因子受体1(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1,VEGFR1)、血小板衍生生长因子受体(Platelet Derived Growth Factor Receptor Alpha,PDGFRA)、成纤维细胞生长因子Ⅱ型受体(Fibroblast Growth Factor Receptor 2,FGFR2)、Lyn原癌基因(LYN Proto-Oncogene,LYN)、CYP3A4等。见表4。KEGG通路分类主要涉及新陈代谢、环境信息处理等方面。见图8。其中Ras信号通路和PI3K-AKT信号通路富集最显著。其中,与VEGFR2蛋白构象稳定的小分子有:白藜芦醇,结合能为-9.1 kcal/mol,RMSD=1.1 Å;与FGFR2、LYN蛋白构象稳定的小分子有:环巴胺,结合能分别为-10 kcal/mol、-8.9 kcal/mol,RMSD=0.3 Å。见表5～6,图9。

表4 补肾活血方与批准药物之间的共同靶点

表5 补肾活血方与批准药物的关键靶点分子对接参数

表6 补肾活血方及批准药物的活性成分与关键靶点的分子对接结果

图8 补肾活血方与批准药物共同靶点的KEGG富集分类

图9 补肾活血方活性成分与批准药物的关键靶点分子对接模式注:A.白藜芦醇-VEGFR2(PDB ID:3VHE);B.环巴胺-FGFR2(PDB ID:3RI1);C.环巴胺-LYN(PDB ID:6FMN)

2.9 MTT法筛选含药(补肾活血方)血清的最佳血药浓度 与对照组比较,随含药血清作用浓度的升高,对人胚肺成纤维细胞均有明显的抑制作用,抑制程度逐渐增强,呈剂量依赖性,当含药血清的药物浓度达0.062 5倍(1/16)时,使细胞抑制率达到10.06%,该药物剂量下,细胞抑制率较低,对人胚肺成纤维细胞损伤小,药物浓度相对安全,可以考虑将含药血清浓度稀释16倍后的浓度定为该实验的最佳血药浓度。见图10。

图10 不同浓度含药血清对人胚肺成纤维细胞增殖的抑制情况

2.10 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测含药血清对人胚肺成纤维细胞增殖及增殖抑制率的影响 与空白对照组比较,TGF-β1处理组的人胚肺成纤维细胞增殖水平显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),增殖率为15.2%。与TGF-β1处理组比较,含药血清组细胞增殖水平降低,差异有统计学意义(P<0.01),并且用补肾活血方后的细胞增殖抑制率为22.7%。见表7。

表7 含药血清对人胚肺成纤维细胞增殖及增殖抑制率的影响

2.11 各组人胚肺成纤维细胞中COL-Ⅰ、IL-17A、自噬小体LC3-Ⅱ蛋白含量情况 COL-Ⅰ:TGF-β1处理组细胞中COL-Ⅰ蛋白含量较空白组明显增多,而含药血清组细胞中COL-Ⅰ蛋白含量较TGF-β1处理组明显降低。IL-17A:TGF-β1处理组细胞中IL-17A蛋白含量较空白对照组明显增多,而含药血清组细胞中IL-17A蛋白含量较TGF-β1处理组明显减少。LC3-Ⅱ:与TGF-β1处理组比较,含药血清组细胞中LC3-Ⅱ蛋白含量明显增多。见图11。

图11 各组人胚肺成纤维细胞中COL-Ⅰ、IL-17、自噬小体LC3-Ⅱ蛋白含量情况

肺纤维化的发病机制尚未探明,现有的研究认为反复的肺泡上皮损伤触发了纤维化的早期发展。这些损伤,再加上失调的伤口修复和成纤维细胞功能障碍,导致终末期肺纤维化中持续的组织重塑和纤维化[19]。

在IPF循证指南中,推荐有条件地使用尼达尼布和吡非尼酮来治疗IPF[6]。随着时间的推移,这些药物已被证明可以降低IPF患者用力肺活量的下降速度[20-25]。其中,尼达尼布是一种三重酪氨酸激酶的细胞内抑制剂,包括抑制PDGF、FGF、VEGF等受体的激活[26]。吡非尼酮则被证明是一种细胞因子和生长因子调节剂,对多条通路具有抑制作用[27]。但是,这2种药物虽然可以防止IPF的恶化,却不能改善病情,其效果与患者的耐受性相关,现有的临床研究发现恶心和皮疹是吡非尼酮治疗中常见的不良反应,而腹泻和肝功能异常在尼达尼布的治疗中更常见[28]。而中药在确定对抗纤维化有效的基础上,可以通过个体化辨证、配伍或调整剂型等方法最大限度地减少不良反应,增强IPF患者对治疗的依从性和耐受性,从而更好地改善病情。

在先前的临床研究中已发现补肾活血方具有抗纤维化作用[29],但具体机制不明。本研究的实验结果一方面表明了补肾活血方对治疗IPF具有显著特异性,另一方面发现CASP3、TNF、JNK、TP53、AKT1、MAPK3、IL-6、MMP9、CXCL8、PPARG靶点在补肾活血方治疗IPF中发挥着重要作用。另外,汉黄芩素与核心靶点TNF、AKT1、MMP9、TP53均表现出良好的结合构象,可能是该方发挥作用的关键活性成分。不仅如此,为了借助已认证药物寻找新药,分子对接结果显示,补肾活血方中的其他多种成分与已批准药物的关键靶点PDGF、FGF、VEGF的受体以及LYN,也具有稳定的结合力,其亲和力以及方均根偏差(Root-mean-square Deviation,RMSD评分与已批准药物的类似,由此推测,补肾活血方的抗纤维化作用部分地通过阻断PDGF受体、FGF受体、VEGF受体的激活来阻断成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化,抑制上皮-间充质转化,抑制炎症和血管生成而实现,而白藜芦醇、环巴胺最具此类功效。

从富集结果来看,补肾活血方大部分作用于感染和免疫类的通路,受影响较大的通路有细胞因子-细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine Recepetor Interaction)通路、IL-17信号通路、TNF信号通路等。将补肾活血方的核心靶点投射到这些富集的通路中,受影响最大的通路是细胞因子-细胞因子受体相互作用通路,它参与细胞天然和适应性的宿主炎症防御、细胞生长、分化、细胞死亡、血管生成以及发育和修复过程,旨在恢复体内平衡[30]。但是,病理状态下,重复的上皮损伤修复带来的慢性炎症可能导致了纤维化的发生[31]。补肾活血方中的活性成分调控了这一通路中的27个靶点,如趋化性细胞因子,涉及CXC、CC 2个亚族,包括关键的炎症介质IL-1B、IL-6、TNF、IL-17,参与适应免疫的细胞因子:IL-13,以及TGF-β1[32]。在纤维化早期,补肾活血方中的活性成分可能通过这一通路,发挥抗炎作用,减少炎症细胞和细胞因子的积累,在纤维化的后期,补肾活血方中的活性成分可能通过抑制TGF-β1,调节成FGF,从而抑制成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞分化、胶原和纤维连接蛋白的合成以及细胞外基质的沉积。在治疗IPF中这一通路主要是通过调节炎症反应发挥的作用,有实验证据表明,在小鼠中,通过抑制IL-8作用来阻断中性粒细胞趋化可减缓博莱霉素诱导的肺纤维化的发展[33],这佐证了抑制炎症通路在治疗IPF中的重要性。然而在临床试验中,泼尼松、硫唑嘌呤和N-乙酰半胱氨酸三联抗炎方案与安慰剂组比较差异无统计学意义,甚至增加了患者的住院及死亡风险[34-35]。关于这一矛盾,有研究者认为IPF患者的自然病史和临床病程差异很大,尚不能确定炎症在多大程度上是疾病的共同驱动因素,还是仅仅是一种附带现象,但可以预测会有一部分患者受益于额外的或者低剂量的抗炎疗法[32],或者说,在一定程度上,部分患者可能通过药物的抗炎机制获益。

除了调节炎症反应,这条通路中还包含了IL-17信号通路、TNF信号通路中的基因,同时也是本研究富集到的2条关键通路,与免疫、肿瘤相关。TNF通过与IL-1β和IL-6协同诱导VEGF的产生,在血管生成中发挥作用[36]。另有研究表明IPF患者的肺泡灌洗液中的VEGF水平与蛋白通透性指数以及MMP3、7和9的水平正相关[37],而血清VEGF浓度则与IPF患者病情严重程度相关,可以作为预测预后的一种生物标志物[38],所以抑制TNF通路或者抑制VEGF受体的激活有望成为治疗IPF的又一机制。通过分子对接发现,补肾活血方中的汉黄芩素(CID5281703)与TNF有稳定的结合构象,具有抗纤维化、抗癌作用[39-41],白藜芦醇(CID445154)与VEGFR2也有着稳定的结合构象,能够通过抑制TGF-β/Smad/ERK信号通路来预防博莱霉素诱导的肺纤维化[42],在体内外通过抑制氧化应激、炎症反应、衰老、纤维化和肿瘤等对肺部疾病有良好的治疗作用[43]。当然,除了补肾活血方中的活性成分在上述关键通路和核心靶点中发挥重要作用之外,传统的“君、臣、佐、使”的配伍也使各个中药发挥着更好的协同作用。此外,实验部分发现补肾活血方可有效的降低人胚肺成纤维细胞内的胶原蛋白的含量,其作用途径可能与阻断IL-17A通路,激活细胞自噬有关,部分验证网络药理学的预测。

综上所述,通过中药网络药理学、分子对接以及实验验证,为补肾活血方中的活性成分通过多靶点多通路治疗IPF提供了客观依据,体现了中药复方多通路多靶点作用的特点,在后续工作应当进一步完善中医证候与生物信息之间的关系,将补肾活血方中的分子对接良好的活性成分,如白藜芦醇、汉黄芩素、环巴胺等进行深入的实验研究验证其抗纤维化的作用机制。

利益冲突声明:无。

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