皂苷类化合物抗肝癌作用机制的研究进展

张哲，龙佳瑶，陈晓勇，饶利兵，林玲，唐根云*（. 广州医科大学研究生院，广州 50000；
. 湖南医药学院，湖南 怀化 48000；
. 三亚中心医院，海南 三亚 57000）

皂苷类化合物是一类苷元为三萜或甾烷类的糖苷类化合物，主要分布于人参、柴胡、桔梗、甘草等高等植物中，少量存在于海星、海参、珊瑚等海洋生物中。现代药理学研究表明，皂苷类化合物具有显著的抗肿瘤作用[1]，其在抗肝癌[2]、胃癌[3]、肺癌[4]、白血病[5]等恶性肿瘤药理机制的研究中取得了较大进展。原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），又称肝细胞癌，占据所有肝癌类型的70%～90%，其病死率在所有恶性肿瘤中居第四位[6]。NCCN指南指出[7]，临床上治疗中晚期HCC患者常采用姑息性手术、化疗、放疗及免疫治疗等方法。考虑到这些手段有着较明显的不良反应和并发症，限制了其在HCC患者中的广泛应用，所以寻找并开发新型有效、毒性较低、适应性更广的抗肝癌药物具有重要意义。我国传统植物药滇重楼、人参、柴胡、桔梗、地肤子中富含的天然皂苷毒副作用小且药理活性广泛，能够通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、增加细胞自噬、阻滞细胞周期、抑制肿瘤侵袭转移及肿瘤耐药性等多途径发挥抗肝癌作用。因此，笔者归纳总结了近20年的国内外文献，首次系统综述滇重楼、人参、柴胡、桔梗、地肤子皂苷抗肝癌的药理作用机制，以期为先导化合物的发现与新药的开发提供新思路。

1.1 抑制肝癌细胞增殖

不受机体控制地无限增殖几乎是所有肿瘤细胞的一个共同特点[8]。许多皂苷类化合物可以通过表观遗传学如DNA甲基化、转录后修饰调节基因的表达来抑制肝癌细胞的增殖。人参皂苷Rh2在体内外均可通过上调miR-491，促进表皮生长因子受体（EGFR）mRNA降解，从而抑制细胞的增殖[9]。DNA甲基转移酶（DNMT）是DNA甲基化修饰的关键酶，可使启动子CpG岛序列上的胞嘧啶发生甲基化来抑制基因的转录。Teng等[10]采用高效液相色谱结合质谱法从人参中分离出20（R）-人参皂苷Rg3、20（S）-人参皂苷Rg3，经鉴定两者均可通过增加DNMT3a、DNMT3b的表达，促进基因P53转录，并甲基化血管内皮生长因子（VEGF）的启动子来抑制肝癌细胞增殖，而体外实验表明后者效果较前者更优。此外，人参皂苷Rh2可下调甲基转移酶Zeste同源物2的增强子（EZH2）的表达，减少基因CDKN2A-2B启动子的甲基化修饰，促进下游基因p14、p15、p16的转录，从而抑制HepG2细胞的增殖[11]。环氧合酶-2（COX-2）是前列腺素生成的限速酶，与肿瘤细胞的增殖成正相关[12]。Ren等[13]报道柴胡皂苷d可以通过激活信号转导和转录激活因子3（STAT3）/增强子结合蛋白β（C/EBPβ）信号通路降低肝癌细胞中COX-2的水平，提示其在肝癌治疗中的潜在作用。

皂苷类化合物抑制肝癌细胞增殖主要源于对表观遗传学及转录后修饰的调节，通过增加甲基转移酶DNMT3a、DNMT3b、EZH2及非编码RNA miR-491的表达，驱动下游基因的转录与翻译。此外，在抑制肝癌细胞增殖过程中，翻译后修饰作为蛋白质成熟的关键环节，亦可能是皂苷类化合物的候选作用靶点。

1.2 促进肝癌细胞凋亡

凋亡是指细胞自主发生程序性死亡的过程[14]。皂苷类化合物促进肝癌细胞凋亡主要包括内源性途径[15-17]、外源性途径[18-19]、内源性与外源性双途径[19-20]及内质网应激[21-22]四种方式，其通过直接或间接作用于下游凋亡相关基因来介导胱天蛋白酶（Caspase）的激活导致细胞死亡（见图1）。

图1 皂苷类化合物促进肝癌细胞凋亡机制图Fig 1 Mechanisms of saponins promoting apoptosis of hepatocellular carcinoma cells

1.2.1 内源性途径 细胞内染色体DNA发生损伤或断裂、线粒体动力学紊乱及活性氧（ROS）激增均可使肿瘤细胞经内源性途径发生凋亡[14]。一般而言，某种因素单独作用或多种因素相互叠加促使抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax的比例发生改变，增加线粒体膜通透性，释放大量细胞色素C，从而激活凋亡执行蛋白Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，诱导细胞凋亡[14]。人参皂苷作为经典的天然皂苷类化合物具有显著的促肝癌细胞凋亡作用。人参皂苷Rk1和人参皂苷Rg5在结构上互为同分异构体，是从人参中新提取的一类小分子皂苷化合物，可同时激活MHCC-97H细胞中丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路与核因子-κB（NF-κB）信号通路致使细胞发生内源性途径凋亡[23]。另外，人参皂苷Rh2通过降低凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比例激活Caspase-3，促进肝癌细胞凋亡[15，24]。桔梗皂苷D亦可通过增加H22细胞静脉注射的荷瘤裸鼠中促凋亡蛋白Bax、切割型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的水平来诱导其凋亡[25-26]。

随着人们对肠道微生物菌群的重视，目前肝肠轴的发生机制已成为肝癌治疗的研究热点之一。Compound K是人参皂苷在肠道微生物代谢中提取出的一种具有明显抗肿瘤作用的化合物。研究发现[27]，Compound K可呈时间依赖性与剂量依赖性地增加促凋亡蛋白Bid的表达，激活线粒体途径促进BEL7402、SMMC-7221细胞凋亡。为了广泛开发Compound K的抗肿瘤疗效，Zhang等[17]利用壳聚糖来源的归巢肽纳米胶束作为药物的运输载体，在体外实验中，相比于对照组，当给药质量浓度超过20 μg·mL－1时，含运输载体的Compound K可明显增加肝癌细胞的凋亡率。

百合科植物滇重楼中富含多种天然皂苷类成分，其中以皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ研究最为广泛，体外实验表明这四种化合物对肝癌细胞均有细胞毒作用[16]。滇重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ通过协同作用于线粒体依赖途径促进肝癌细胞凋亡[28]，其中滇重楼皂苷Ⅰ主要调控p53基因的表达，增加线粒体膜通透性并释放细胞色素C，导致细胞内ROS的含量激增，激活Caspase-9、Caspase-3、PARP，促HepaRG细胞凋亡[16]。此外，柴胡皂苷d能通过Caspase-3依赖性、非依赖性及线粒体途径三种方式共同诱导细胞凋亡，在使用Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK后仅能部分消除皂苷对肝癌细胞的促凋亡作用[29]。

1.2.2 外源性途径 细胞凋亡外源性途径亦称死亡受体介导的细胞凋亡，是指细胞外多种信号分子特异性结合细胞膜表面的Fas受体，以此诱导Fas相关死亡结构域（FADD）复合体活化，切割Caspase-8前体蛋白，进一步激活Caspase-3，最终导致细胞凋亡的过程[30]。柴胡皂苷d通过抑制NF-κB信号通路，增加Fas受体的表达，诱导p53基因阳性表达的HepG2细胞发生外源性凋亡[31]。另一种天然皂苷类化合物滇重楼皂苷Ⅰ可剂量依赖性地增加p53蛋白、Fas受体蛋白的表达，促进肝癌细胞凋亡[18]。而人参皂苷Rk1抗肝癌作用是以非FADD依赖的信号途径激活Caspase-8、Caspase-3，其机制可能与端粒酶的活性受抑制有关[32]。

1.2.3 内源性与外源性双重途径 天然皂苷类化合物多靶点、多通路的药理作用更有利于协同发挥抗肿瘤效应。滇重楼皂苷Ⅶ可经MAPK通路与PTEN/p53通路介导HepG2细胞发生内源性与外源性凋亡，在使用PTEN、MAPK通路抑制剂后细胞凋亡率显著降低[19]。类似地，滇重楼皂苷Ⅱ也可以同时激活内外双途径促进肝癌细胞凋亡[33]。人参皂苷Rh2可使SK-HEP-1细胞内Bcl-2/Bax比例下调，Caspase-8、Caspase-9表达水平增加，诱导细胞凋亡[34]。此外，有研究发现地肤子皂苷momordin Ic可介导一种新型促肝癌细胞凋亡的机制，momordin Ic通过激活抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路与MAPK信号通路，增加下游转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）入核启动叉头框转录因子4（FoxO4）、COX-2基因的转录，导致肝癌细胞凋亡，而这种机制可能并不直接依赖于Caspase家族成员，但可促进RARP蛋白的切割导致细胞凋亡[35]。最新研究显示，桔梗皂苷D与核糖体失活蛋白能协同抑制PI3K/Akt、细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）信号通路，并磷酸化MAPK通路中的c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38蛋白，从而使肝癌细胞发生Caspase-3依赖性凋亡[20]。

1.2.4 内质网应激 蛋白质的正确折叠与成熟依赖于内质网的动态调控，当细胞内外环境发生变化时会打破蛋白质的生成平衡，激活内质网信号通路，导致内质网应激的发生，促使细胞凋亡[36]。转录因子C/EBP同源蛋白（CHOP）既作为内质网应激中的关键蛋白，又参与调节细胞凋亡，在细胞死亡方式的调节中扮演着重要的角色[36]。人参皂苷Rg3通过上调CHOP介导的死亡受体5（DR5）的表达，促进肺癌细胞凋亡[37]。近期一项研究显示，Compound K可抑制STAT3的磷酸化，使其无法形成二聚体结构，削弱STAT3入核结合DNA的能力，导致HepG2、SMMC-7221细胞发生内质网应激和凋亡[22]。然而，Luo等[21]研究发现，重楼皂苷Ⅰ以内源性途径促进细胞凋亡的同时，还通过CHOP非依赖途径激活核糖核酸内切酶肌醇需求酶1（IRE-1）信号通路抑制HepG2细胞凋亡，显示了其促细胞凋亡的双向机制。

总之，天然皂苷类化合物可通过内源性途径、外源性途径、内源性与外源性双重途径及内质网应激等多种途径促进肝癌细胞凋亡（见图1）。但皂苷类化合物药理机制复杂，具有多靶点、多途径作用的特点，例如，滇重楼皂苷Ⅰ经内源性途径促进肝癌细胞凋亡同时，也能激活内质网应激抑制凋亡，这就给皂苷类化合物作用机制的研究带来了新的挑战。所以，笔者认为后期研究者可采用网络药理学结合实验验证的方法多维度揭示皂苷的分子调节网络。另外，在皂苷促凋亡的机制研究中大多局限在体外实验，应增加如裸鼠成瘤模型等体内实验进一步验证相关机制。

1.3 促进肝癌细胞自噬

自噬是指细胞内衰老的细胞器和某些蛋白质等成分被光面内质网膜包裹，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体后将其降解，以实现细胞自我更新的过程[38]。适度自噬可延缓细胞衰老，但过度自噬会导致细胞凋亡。越来越多的研究表明自噬是皂苷类化合物发挥抗肿瘤作用的新途径，其中哺乳动物雷帕霉素受体（mTOR）途径是自噬上游负性调节的经典信号通路[39]。滇重楼皂苷Ⅰ、Ⅶ均可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进HepG2细胞自噬，诱导细胞凋亡[40-41]，而滇重楼皂苷Ⅶ还能通过激活ADP活化的蛋白激酶（AMPK）、JNK通路诱导HepG2肝癌细胞过度自噬来发挥抗肝癌作用[41]。柴胡皂苷d作用于SMMC-7721和MHCC97L细胞后，亦可抑制mTOR的磷酸化，增加下游自噬相关蛋白LC3-ⅡBeclin-1的表达，促进细胞自噬[42]。另一项研究发现，柴胡皂苷d可增加肝癌细胞对放疗的敏感性，其原因在于柴胡皂苷d可通过诱导自噬增加来提高肝癌细胞对放疗的敏感性，但是，在使用自噬抑制剂后，仅能部分逆转柴胡皂苷d的放疗增敏作用，表明可能存在其他机制参与自噬的调节[43]。

上述研究表明，皂苷类化合物可通过激活AMPK、JNK通路，抑制PI3K/Akt/mTOR途径增强自噬，进而促进肝癌细胞凋亡，其中，多数皂苷类化合物通过直接或间接抑制PI3K/Akt/mTOR通路来发挥抗肝癌作用，这可为其他天然分子提供有效的作用靶点。

1.4 阻滞肝癌细胞周期

细胞周期是指从上一次细胞分裂结束时开始到下一次细胞分裂结束时为止的时间过程[44]。该过程需要周期蛋白激酶（CDK）与周期蛋白（Cyclin）的广泛参与，CDK与Cyclin结合形成复合物后激活下游的特定基因，维持周期的正常运转[44]。阻滞肝癌细胞周期在任意时期均可显著抑制肝癌细胞的增殖。CDK2、CDK4/6系参与细胞周期S期、G1期的关键激酶，可以精准调控细胞的增殖。人参皂苷Rh2可显著降低CDK2、CDK4/6的表达，将SK-HEP-1细胞分别阻滞于G1/S期、G0/G1期，实验证实，人参皂苷Rh2可直接结合热休克蛋白90A（HSP90A），后者减少与细胞分裂周期控制蛋白37（CDC37）结合，抑制CDK正确折叠和成熟[45]。滇重楼皂苷Ⅰ与formosanin C均是从滇重楼中提取的主要皂苷成分，两者以1∶1的比例混合体外处理肝癌细胞，可协同减少CDK2/CyclinE复合物的形成，使细胞停留在G1期[28]。另有研究发现，滇重楼皂苷Ⅱ亦具有类似的抗肿瘤作用，可将HepaRG细胞与HL-7702细胞阻滞于S期，且呈剂量依赖性[33]。细胞周期检查点专司细胞周期精确调控，保证细胞能够进行正常的DNA复制与染色体的分离[44]。柴胡皂苷d通过促进p53表达，上调p21/WAF1的水平，阻滞肝癌细胞于G1期[31]。此外，在低氧条件下，柴胡皂苷d可将SMMC-7721细胞的细胞周期同时阻滞于G0/G1期与G2/M期，而恢复常氧后却失去了对细胞G2/M期的阻滞作用，这一特性能更好地遏制肿瘤细胞在缺氧条件下旺盛生长的速率[46]（见表1）。

表1 皂苷类化合物抑制肝癌细胞周期Tab 1 Cell cycle of saponins with anti-hepatocellular carcinoma

人参皂苷Rh2、滇重楼皂苷Ⅰ、滇重楼皂苷Ⅱ及柴胡皂苷d以阻滞细胞周期的方式来抑制肝癌细胞的生长。其主要药理机制不仅可以影响细胞周期相关调节蛋白CDK2、CDK4/6、CyclinE的表达，还能在不同氧环境条件下适应性地调节细胞周期上游蛋白p53的水平，抑制肝癌细胞周期。

1.5 抑制肝癌细胞侵袭和转移

肿瘤细胞的侵袭和转移是指肿瘤细胞经血管、淋巴管迁徙到机体的不同部位形成同类型的肿瘤[47]。该过程通常需要上皮钙黏蛋白（E-cadherin）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、基质金属蛋白酶（MMP）的参与[48]。人参皂苷Compound K可促进NF-κB的核因子p65出核，减少下游MMP-2与MMP-9的表达，抑制MHCC97-H细胞的转移能力[49]。人参皂苷Rh2抑制HepG2肝癌细胞迁移与MMP-3的高表达有关[15]。近期研究发现，地肤子皂苷momordin Ic一方面通过激活PPARγ，抑制COX-2、MMP-9蛋白的表达[50]；
另一方面可以磷酸化MAPK（ERK、p38、JNK）信号通路，抑制ICAM-1和VCAM-1的表达，促进E-cadherin的表达，协同减弱肝癌细胞的侵袭和转移能力[51]。血管生成拟态（VM）与肿瘤的侵袭和转移密切相关，主要是指具备类上皮细胞功能的肿瘤细胞形成微血管来供应自身生长必需的营养物质[52]。滇重楼皂苷Ⅰ通过抑制PI3K/Akt/Twist/E-cadherin通路降低VM的形成，其抑制VM的两种主要机制：① 抑制Twist启动子的转录激活；
② 干扰Twist的稳定性，减少与下游E-cadherin的启动子结合[53]。此外，滇重楼皂苷Ⅱ能抑制Akt/NF-κB通路，进而降低HepG2与BEL7402细胞分泌MMP-2、MMP-9，从而削弱其侵袭转移能力[54]。

上述研究提示，皂苷类化合物可以通过调节PPARγ、MAPK、Akt/NF-κB信号通路及相关蛋白的表达，抑制肝癌细胞的侵袭和转移。虽然人参皂苷Compound K与滇重楼皂苷Ⅱ在药理机制上均能抑制肝癌的转移能力，但两者介导NF-κB途径的活化形式不同，笔者认为除了使用的细胞模型不同外，还可能存在其他潜在机制。

1.6 降低肝癌细胞耐药性

对常规化疗药物的耐药是癌症治疗失败的重要原因之一。在化疗药物干预下，肝癌细胞可通过增强自噬降低化疗药对胞内细胞器的破坏，而抑制细胞自噬可明显降低肝癌细胞对化疗药物的耐药性[55]。人参皂苷Rg3联合阿霉素治疗HCC移植瘤裸鼠，与对照组相比，能显著提高肝癌细胞对阿霉素的敏感性，因为人参皂苷Rg3作为新发现的自噬抑制剂，可减少肝癌细胞中自噬小体的形成[56]。此外，人参皂苷Rg3经由CHOP上调DR5介导内质网应激途径来降低肝癌细胞的耐药性[37]。丝切蛋白-1（cofilin-1）是与肝癌细胞增殖、侵袭、迁移密切相关的蛋白[57]。研究表明，桔梗皂苷D通过抑制ERK1/2介导的cofilin-1的磷酸化，逆转肝癌细胞对组蛋白去乙酰化酶抑制剂的耐药性[58]。肿瘤耐药的内体逃逸机制是指脂溶性小分子化疗药物从内涵体（endosome）中逃逸的过程[59]。Lei等[20]发现桔梗皂苷D在不损伤细胞器膜的前提下促进内体逃逸，从而逆转HepG2细胞对化疗药的耐药性。

因此，皂苷类化合物可通过抑制细胞自噬、促进内质网应激及激活ERK1/2通路增加肝癌细胞化疗药物的敏感性。同时，皂苷类化合物联合化疗药治疗的效果要大于单药治疗，显著逆转肝癌细胞的耐药性。另外，天然皂苷类化合物通过增加内体逃逸可能是未来研究肿瘤耐药的新方向（见表2）。

表2 皂苷类化合物抗肝癌的作用机制Tab 2 Mechanism of saponins against hepatocellular carcinoma

天然皂苷类化合物是从滇重楼、人参、柴胡、桔梗及地肤子等传统植物药中提取出来且具有广泛抑制肝癌药理活性的糖苷类化合物，其具体机制包括抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡、促进细胞自噬、阻滞细胞周期、抑制肿瘤侵袭转移及肿瘤耐药等。这些皂苷类化合物通过多靶点、多途径协同发挥治疗肝癌的作用，成为国内外研究者寻找的疗效更佳、毒性更低的候选先导化合物。然而，由于目前大部分皂苷类化合物的体内研究较少，无法得到更高循证等级的研究结论。目前，有少数皂苷类化合物如人参皂苷Rg3已经开始应用于Ⅱ期临床试验[8，60]，该研究主要的入选对象包括HCCⅠ期或Ⅱ期以及进展期的受试者，这一突破为这类患者带来了福音。此外，人参皂苷作为一种研究较早且应用广泛的天然皂苷，不仅在治疗肝癌方面起作用，还可以显著提高患者的免疫力，而这一特点亦为肿瘤的免疫治疗提供了新思路[47]。因此，研究者们下一步可充分挖掘各种皂苷类化合物的潜在药理机制，并结合现代分子生物学技术如三代测序、代谢组学、纳米传递系统等新兴技术，为先导化合物的合成与新药的研发提供可靠的基础理论。

猜你喜欢重楼类化合物皂苷方修《重楼小诗》中的《红楼梦》情怀红楼梦学刊(2020年2期)2020-02-06重楼：梁春宏的脱贫“药方”当代陕西(2019年6期)2019-04-17保健酒中非法添加一种西地那非类化合物的确证中成药(2018年12期)2018-12-29HPLC-MS/MS法同时测定三七花总皂苷中2种成分中成药(2018年9期)2018-10-09HPLC法测定大鼠皮肤中三七皂苷R1和人参皂苷Rb1中成药(2017年9期)2017-12-19多叶重楼与云南重楼中4种重楼皂苷的积累差异中成药(2017年7期)2017-11-22基于HPLC指纹图谱鉴别云南重楼和长柱重楼中成药(2017年8期)2017-11-22HPLC法同时测定熟三七散中13种皂苷中成药(2017年6期)2017-06-13一锅法合成苯并噁唑类化合物中南大学学报（自然科学版）(2016年2期)2017-01-19新型环磷腈类化合物的合成合成化学(2015年1期)2016-01-17

推荐访问:研究进展 肝癌 机制