灰色关联分析结合聚类分析评价不同产地板蓝根饮片质量*

庞文娟，张生杰，田志梅

（武威市药品检验检测中心，甘肃 武威 733000）

板蓝根饮片是一种具有广谱抗病毒活性的中药[1]，在我国已有上千年的用药历史。其来源是十字花科植物菘蓝（Isatis indigoticaFort.）的干燥根[2]，属二年生草本植物，在甘肃张掖地区有大规模的人工种植。在中医临床上，板蓝根主要用于治疗温热病初起，长于利咽喉，解温热火毒，在治疗咽喉肿痛常配伍牛蒡子使用。现代药理学实验[3-4]证实，板蓝根具有抗病毒、抗菌、免疫调节、抗炎和利胆作用，并能抑制多种病毒引起的疾病。临床上板蓝根主要用于治疗咽喉疼痛、感冒、发热、病毒性肝炎和流行性乙型脑炎[5]。LI Z T等[6]通过临床试验全面评估了板蓝根治疗甲型和乙型流感病毒抗流感感染的有效性和安全性。在近些年公共卫生事件中，板蓝根广泛应用于病毒引起的各种疾病的预防和治疗，疗效显著。CHEN Q等[7]通过网络药理学的方法研究发现板蓝根对新型冠状病毒感染具有潜在的药理作用。板蓝根抗病毒活性主要取决于水溶性成分，包括氨基酸、核苷、含硫生物碱等。药理活性主要依赖于其多种成分的协同作用，通过直接杀灭病原病毒或调节免疫系统以增强抗病毒能力[1]。控制好药材质量是保证临床疗效的重要手段，目前板蓝根主要来源是人工种植[8]，建立一种全面、客观的药材质量评价方法对保证药材质量尤为重要。

灰色关联度分析（grey relation analysis，GRA）是研究多重因素的现代统计分析方法，用关联度或者相对关联度来表示研究对象之间的相关性，广泛应用于经济、社会、科学研究等各领域[9]。在中药的质量控制、中药生产中关键工艺参数筛选、谱效关系研究方面灰色关联分析已有应用[10-14]。为了客观有效地评价板蓝根饮片的质量，本研究根据2020年版《中华人民共和国药典》标准，测定板蓝根饮片水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、（R、S）-告依春（C5H7NOS）的含量，并用层次分析法（AHP）确定指标的权重，旨在建立灰色关联分析和聚类分析板蓝根饮片质量评价模型。

1.1 仪器 Agilent1260Ⅱ高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；
UN110恒温烘箱（美墨尔特）；
MS205D十万分之一电子天平（梅特勒-托利多公司）；
F0410箱式电阻炉（重庆雅马拓科技有限公司）。

1.2 药品与试剂（R，S）-告依春（C5H7NOS）（批号：111753-202007，含量：100.0%）购于中国食品药品检定研究院；
色谱纯甲醇（批号：10951807816）购于德国Merck公司；
色谱纯磷酸（批号：J2111704）购于阿拉丁；
其他试剂均为分析纯。

40批板蓝根饮片来自市场抽检，分别抽检中药饮片生产企业20批，药品经营企业10批，使用单位10批。（见表1）40批样品均经武威市药品检验检测中心副主任中药师张生杰鉴定为板蓝根饮片。

表1 40 批板蓝根饮片样品来源

2.1 板蓝根饮片各指标性成分测定 按照2020年版《中华人民共和国药典》一部板蓝根饮片标准[含量测定]项下色谱条件[1]，测定板蓝根饮片中（R，S）-告依春（C5H7NOS）含量。色谱条件：色谱柱为Shim-pack GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相为甲醇-0.02%磷酸溶液（7∶93）；
流速为1.0 mL/min；
柱温为30 ℃；
检测波长为245 nm；
进样量为20 μL。按照2020年版《中华人民共和国药典》四部（通则0832第二法）测定水分，照通则2302测定总灰分和酸不溶性灰分，按照通则2201项下醇溶性浸出物测定法的热浸法测定浸出物[15]，结果见表2。

表2 不同批次板蓝根饮片水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、告依春的含量

2.2 指标权重的确定 在利用多个评价指标进行综合评判时，各指标在整体中贡献和重要程度不同，不考虑量化指标权重的大小，简单认为所有的评价指标的贡献程度相同，这在实际评价中缺乏合理性，因此在利用多个综合指标评价时，确定指标权重能更真实、客观体现事物本质特性[16]。计算权重常用的方法有7种，不同计算方法的区别主要是应用原理不相同，在实际应用过程中，要结合具体问题选择适合的计算方法[17]。药品质量评价多采用层次分析法来计算指标权重。本研究同样采用层次分析法计算权重，根据指标对板蓝根质量贡献大小，对指标进行赋值（1.同等重要；
3.A比B稍微重要；
5.A比B明显重要；
7.A比B强烈重要；
9.A比B极端重要）：（R，S）-告依春（7）、浸出物（5）、总灰分（3）、酸不溶性灰分（3）、水分（1），并计算指标权重Wj。5个评价指标的权重Wj分别为：（R，S）-告依春（0.368）、浸出物（0.263）、总灰分（0.158）、酸不溶性灰分（0.158）、水分（0.053）。

2.3 板蓝根饮片质量灰色关联分析

2.3.1 参考序列的选择 设有n个检验样品，且每个样品有m个评价指标，组成一个评价序列{Xik}（i=1，2，3，...，n；
k=1，2，3，...，m）（本研究中n=40，m=5）。取负向评价指标水分、酸不溶性灰分、总灰分倒数作为评价指标，与浸出物和（R，S）-告依春含量共同构成指标矩阵。

2.3.2 确定参考数据列 设各指标的最大值构成最优参考数据列，记作{Xsk}，Xsk=x′0（1），x′0（2），...，x′0（m）；
各指标的最小值构成最差参考数据列，记作{Xtk}，Xtk=x′0（1），x′0（2），...，x′0（m）。

2.3.3 对指标数据进行无量纲化 在实际分析中，分析数据很难完全表征事件本身特征，且表示物理意义也不同，如果不对数据进行无量纲化处理，就很难得到正确的分析结论。通常数据无量纲化处理，多使用标准化、均值化、标准方差法以消除彼此之间的影响。本研究用均值化对测量数据进行无量纲化处理，计算方法见公式[1]。

式中xi（k）为量纲化处理后的数据，x′i（k）表示原始数据。

2.3.4 计算关联系数 根据公式[2]计算分析对象对应最佳参考序列的关联系数，根据公式[3]计算分析对象对应最差参考序列的关联系数。其中ρ为分辨系数，表示关联系数之间的差异，ρ取值在0到1之间，当ρ越小时，表示差异越显著，分辨率越高。一般用ρ=0.5计算关联系数，这样可简化计算过程，同时也能满足分辨率[18]。

2.3.5 关联度及相对关联度 因指标彼此间的物理意义、表征特征属性不同，所以在分析时引入了样品评价指标权重Wj，来体现各指标不同的贡献。按公式[4]计算相对于最佳参考序列的关联度，按公式[5]计算相对于最差参考序列的关联度，按公式[6]计算板蓝根饮片的相对关联度rj，根据相对关联度的大小，按大到小依次排序，结果见表3。

表3 评价单元序列相对于最优参考序列的关联系数、关联度、相对关联度及排序

2.3.6 结果 通过对40批不同来源板蓝根饮片质量指标进行灰色关联度分析，确定指标权重（R，S）-告依春（0.368）、浸出物（0.263）、总灰分（0.158）、酸不溶性灰分（0.158）、水分（0.053），确定参考数据列，对指标数据进行无量纲化，计算关联系数，并对相关系数关联度进行排序，发现37批板蓝根饮片相对关联度介于0.387～0.499，表明板蓝根饮片质量总体稳定，相对关联度大于0.500的样品有3批（S28、S29、S31），表明这3批板蓝根饮片质量明显优于其他。通过相对关联度排序可知，S28板蓝根饮片样品质量最好，S22质量最差。

2.4 聚类分析 以5个质量指标关联系数为变量，研究40批板蓝根饮片样品的质量，构成40个样本×5阶关联系数矩阵，采用统计软件SPSS Statistics 20.0进行聚类分析。样本聚类分析采用组间连接法，以欧几里得平方距离为区间，当分类距离为5时，40批板蓝根饮片样品分成3类，S28为一类，即第1类，S13、S29、S31归为第2类，其余36批归为第3类。从聚类分析结果和表3灰色关联分析方法结果来看，S28样品质量最优，并远好于其他样品单独归为一类，并在灰色关联分析排序为第1位；
S31、S29、S13样品在灰色关联分析排序分别为2、3、6位，表明此类样品质量相近，排序靠前质量较好，其余36批样品归为第3类，表明市场上销售的绝大数的板蓝根饮片质量相近、质量稳定。（见图1）

图1 40 批板蓝根聚类分析树状图

中药化学成分非常复杂，含有多种类型的已知或未知成分，很难具体确定那一种是发挥药效作用的成分。中药发挥药效作用的特点就是各成分协同参与、多途径、多靶点发挥药理活性[19]。若从简单的几种化学成分含量多少来评价中药质量，这就违背传统中医理论体系[20]。因此，建立一种不同物理意义的多种指标同时评价中药质量，对中药的应用和开发具有重要意义。基于灰色关联度分析模型在模糊系统研究中的优势，根据传统经验对评价指标进行打分，由层次分析法确定的指标权重能客观反映其内在品质。从分析结果来看，92.5%的板蓝根饮片相对关联度在0.387~0.499之间，只有S28、S29和S31板蓝根饮片相对关联度在0.500以上，表明这3批板蓝根饮片的质量明显优于其他批次。表明市场上销售的板蓝根饮片质量相对稳定，客观上反映了市售板蓝根饮片大部分来自人工种植。相对关联度排序显示，编号S28质量最好，其（R，S）-告依春和浸出物的含量最高。这从质量研究的角度证实了浸出物、活性成分含量越高，质量越好的结论[21-22]。

为进一步澄清相对关联度在0.387~0.499之间的板蓝根饮片质量是否存在差异，本研究对40批板蓝根饮片样品的质量进行了聚类分析。聚类分析法是研究分类的统计学方法，具体方法是通过计算样本之间的距离，将距离接近的归为一类，不断计算类与类之间的距离，直到归一类为止[23]。当类间距为5时，40批板蓝根饮片分为3类，仅S28为第1类，S13、S29和S31为第2类，其余36批为第3类。结合灰色关联度的分析结果，样品S28相对关联度排第1位，说明S28的质量明显优于其他样品。S13、S29和S31排序同样位居前列并归为一类，表明其质量较好并接近。第3类相对关联度在0.387~0.499之间，占样品总量90%，说明板蓝根饮片质量相对稳定。两种不同的分析方法共同证明了一个结论，相互印证，证实了灰色关联分析的准确性。

本研究建立的灰色关联分析综合评价模型与聚类分析相结合，适用于多指标的中药质量综合评价，方法简单直观。同时，也为其他中药的质量评价提供了新的思路和方法。

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