湖北‘天仙红’桃树流胶病病原菌鉴定

刘勇 龚林忠 王富荣 王会良 艾小艳 朱炜 张杨 何华平

摘要 流胶病在湖北‘天仙红桃树上发生严重。为明确引起‘天仙红桃流胶病的病原，通过形态学、分子生物学及柯赫氏法则对采集的病害样品进行了病原菌鉴定。结果表明，获得的分离菌株JSZ01的形态学特征与小新壳梭孢Neofusicoccum parvum基本一致。BLAST比对结果显示，分离菌株JSZ01的ITS、TEF1-α和β-tubulin 基因序列与N.parvum的相似性在99.2%～100%，在系统发育进化树中JSZ01与小新壳梭孢的类群处于同一分支。JSZ01接种健康桃树枝条5 d后接种部位出现溃疡流胶症状，与田间症状一致。结合形态学观察、序列分析以及致病性测定结果，将‘天仙红桃树流胶病的病原菌鉴定为N.parvum。

关键词 天仙红桃; 流胶病; 病原菌鉴定; 小新壳梭孢

中图分类号：
S 436.621

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2022002

Abstract Gummosis is a wide spread disease on ‘Tianxianhong peach tree in Hubei province. To identify the pathogen causing peach gummosis， the pathogenic fungus JSZ01 from the diseased twigs was isolated and purified. The morphological and molecular identification of JSZ01 was conducted. The pathogenicity of JSZ01 was confirmed according to Kochs rule. The results indicated that the morphological characteristics of JSZ01 were in agreement with Neofusicoccum parvum. BLAST analysis showed that the rDNA-ITS， TEF1-α and β-tubulin sequences had 99.2% to 100% identity with those of N.parvum. Phylogenetic analysis showed JSZ01 was attributed to the same branch with N.parvum in phylogenetic tree. After five days， the inoculated peach twigs exhibited necrotic lesions and secreted gum from the lesions， which were highly similar to the symptoms observed in the field. Based on the morphological characteristics， sequences analysis and pathogenicity tests， the pathogen that causing gummosis of ‘Tianxianhong peach was identified as N.parvum.

Key words ‘Tianxianhongpeach; gummosis; pathogen identification; Neofusicoccum parvum

桃Prunus persica是湖北省重要栽培水果，2019年全省桃種植面积5.5万 hm 2，产量86.5万t，生产规模居全国第六位［1］。‘天仙红桃是一种湖北地方特色新品种，具有红肉、离核、硬溶质、丰产等优良性状，近年来在湖北产区得到了大力发展。目前，以‘天仙红为核心的早熟桃产业已发展成为大别山南麓丘岗地区农民脱贫致富的支柱产业。随着‘天仙红桃种植规模扩大，流胶病的发生也越来越重。桃流胶病致病因素复杂，分为侵染性流胶病和非侵染性流胶病两种类型，前者由真菌侵染所致，后者则与环境条件、品种、栽培管理措施等因素有关［2］。目前关于侵染性流胶病的报道较多，葡萄座腔菌属Botryosphaeria真菌中的B.dothidea、B.rhodina、B.obtusa均可引起桃树流胶［3-4］。此外，Leptosphaeria pruni、Cucurbitaria spp.、Phoma persicae、Phomopsis spp.等真菌在条件适宜时也能引起桃枝干溃疡或流胶［5］。由于致病因素复杂，生产上尚缺乏有效的防控手段。鉴于此，本研究对‘天仙红桃树流胶病的发病特点及其病原物进行了初步研究，以期为本产区桃树流胶病的防控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从湖北省孝昌县7年生‘天仙红桃树采集表现明显流胶症状的枝干样品10份，用于病原菌的分离;选用湖北省武汉市江夏区金水闸桃资源圃内种植的6年生‘天仙红桃树新梢枝条进行致病性测定。

1.2 病原菌的分离纯化

采用常规组织分离法［6］对感病枝条样品病健交界处组织进行分离纯化，获得的病原菌分离菌株置于4℃冰箱保存备用。

1.3 病原菌的形态学观察

将分离菌株接种于PDA平板上于25℃培养，观察记录菌落形态。参照雷建姣等［7］的方法，将分离菌株接种到含有松针的水琼脂培养基（WA）上培养，待松针表面形成子实体后在显微镜下观察分生孢子形态。

1.4 病原菌的分子生物学鉴定

采用真菌基因组DNA抽提试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）提取菌丝基因组 DNA。具体方法参照试剂盒说明书。采用真菌通用鉴定引物ITS1/ITS4［8］、Bt2a/Bt2b［9］和EF1-728F/EF1-986R［10］分别对分离菌株的核榶体内转录间隔区（rDNA-ITS）、β微管蛋白（β-tubulin）、翻译延伸因子（TEF1-α）基因序列进行PCR扩增，获得的PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序。测序结果提交至GenBank，在NCBI数据库（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）中进行序列比对，并采用MEGA X软件构建系统发育进化树以确定病原菌的分类地位。

1.5 病原菌的致病性测定

参照Gao等［11］的方法，略有改动。选取健康、粗细一致的一年生‘天仙红枝条，剪成长约15 cm左右的枝段，75%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗3次，晾干备用。用无菌接种针在枝条中间部位针刺4针，取直径为0.5 cm的菌饼接种于伤口上，以接种无菌培养基为对照，每个处理接种10根枝条。接种后的枝条置于白瓷盘（长30 cm，宽20 cm，高5 cm）中，浸湿的灭菌吸水纸铺在盘底，用保鲜膜覆盖瓷盘保湿，26℃恒温培养（L∥D=12 h∥12 h），培养2 d后去除菌饼。接种5 d后观察不同处理枝条的发病情况。

2 结果与分析

2.1 田间症状表现

流胶病主要危害‘天仙红桃树主干和侧枝，也可危害当年新生梢枝。发病初期被害枝干表面形成隆起的小疱斑，条件适宜时病斑皮层开裂，溢出无色透明胶体，氧化后变为金黄色，最后形成茶褐色或黑褐色胶体附着在枝干上，发病严重时树干密布流胶点，导致树势衰弱（图1）。该病害在湖北产区每年1月－4月危害较轻，5月以后开始逐步加重，7月－9月是其危害高峰期，部分果园的发病率高达100%。

2.2 病原菌的形态学特征

采用组织分离法从10份样品中获得了17个菌落形态一致的分离菌株。分离菌株在PDA平板上菌落呈圆形或近圆形，气生菌丝发达，生长高度可以达到并贴紧培养皿盖。菌落边缘不整齐，初期灰白色，培养5～6 d后气生菌丝变为灰黑色（图2a），基质菌丝变为黑色（图2b）。分生孢子器着生在松针表面，黑色、近球形、单腔。分生孢子单胞，无色透明，纺锤形（图2c），大小为（13.65～20.55） μm×（4.61～7.41） μm （n=50）。分离菌株的培养性状和形态学特征与前人描述的小新壳梭孢Neofusicoccum parvum［7， 12］相符。

2.3 分離菌株的分子生物学鉴定

对代表性分离菌株JSZ01的ITS、β-tubulin和TEF-1α基因进行PCR扩增，分别获得长度为490、418 bp和258 bp的目标片段，将测序获得的基因序列提交至NCBI数据库（NCBI序列登录号分别为OK310848.1、OK337998.1和OK338000.1）。比对结果显示JSZ01的ITS、β-tubulin和TEF-1α基因序列与NCBI登录号为MT645687.1、MN318108.1、MK781982.1等Neofusicoccum parvum分离菌株的相似度分别为100%、99.3%和99.2%。从GenBank数据库中下载 N.parvum、N.ribis、N.brasiliense、Guignardia philoprina等分离菌株ITS、β-tubulin、TEF-1α 基因序列联合构建多基因系统发育树，结果显示分离菌株JSZ01与小新壳梭孢N.parvum的类群聚为一支（图3）。结合形态学特征及分子鉴定，确定分离菌株为N.parvum。

2.4 病原菌的致病性测定

采用菌丝块接种的方法将分离菌株JSZ01接种到一年生‘天仙红枝条上。接种后5 d，分离菌株JSZ01菌丝块接种点周边组织出现椭圆形深褐色溃疡斑并溢出透明胶体 （图4a），而PDA琼脂块接种的空白对照枝条均未发病（图4b）。取病健交界处组织进行病原菌的再分离，获得与原接种菌一致的分离菌株。根据柯赫氏法则判定JSZ01菌株为导致‘天仙红桃枝条产生流胶症状的病原菌。

3 结论与讨论

本研究对表现流胶症状的‘天仙红桃枝干样品进行了病原菌分离，得到的分离菌株JSZ01在PDA培养基上不产生分生孢子但在含松针的水琼脂培养基（WA）上可产分生孢子，与雷建姣等［7］的研究结果一致。鉴于传统的形态学特征尚不能准确鉴定Botryosphaeria真菌［3］，本研究同时扩增分离菌株JSZ01的ITS、β-tubulin和TEF-1α 基因并进行测序比对，构建多基因系统发育进化树进行分析。结合形态学特征和分子鉴定结果，确定分离菌株JSZ01为小新壳梭孢Neofusicoccum parvum。侵染性桃流胶病主要病原为Botryosphaeria真菌（有性型），其无性型包括壳梭孢属Fusicoccum真菌［4］。本研究中分离菌株JSZ01为新壳梭孢属Neofusicoccum真菌，在分类上是从Fusicoccum演化出来的新属［13］，研究结果为后期进行侵染性桃树流胶病病原研究提供了新的信息，为将来开展病原性流胶病的致病机理及防控研究提供了基础。此外，N.parvum寄主范围广泛，可侵染柑橘、蓝莓、鳄梨、杧果等多种植物［14］，并引起柑橘、杧果等产生溃疡流胶症状［15-16］，本文所分离菌株JSZ01是否能够引起其他桃树品种及其他植物产生流胶症状也值得进一步研究。

参考文献

［1］ 王力荣. 我国桃产业现状与发展建议［J］. 中国果树， 2021（10）：
1-5.

［2］ 叶正文， 李雄伟， 周京一， 等. 桃流胶病研究进展［J］. 上海农业学报， 2020， 36（2）：
146-150.

［3］ 凌金锋， 彭埃天， 殷瑜， 等. 广东‘鹰嘴蜜桃上流胶病病原鉴定［J］. 植物保护， 2017， 43（6）：
85-90.

［4］ WANG Fan， ZHAO Lina， LI Guohuai， et al. Identification and characterization of Botryosphaeria spp. causing gummosis of peach trees in Hubei province， central China ［J］. Plant Disease， 2011， 95（11）：
1378-1384.

［5］ 王璠. 桃流胶病菌Botryosphaeria spp.鉴定、分布、遗传多样性及PCR快速检测技术研究［D］. 武汉：
华中农业大学， 2012.

［6］ 方中达. 植病研究方法［M］. 3版.北京：
中国农业出版社， 1998：
122-145.

［7］ 雷建姣， 汤前， 曲正， 等. 柑橘果实壳梭孢腐烂病的鉴定［J］. 植物病理学报， 2018， 48（5）：
582-586.

［8］ WHITE T J， BRUNS T， LEE S B. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics ［M］∥INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， et al. PCR protocols：
A guide to methods and applications. San Diego：
Academic Press， 1990：
315-322.

［9］ GLASS N L， DONALDSON G C. Development of primer sets designed for use with the PCR to amplify conserved genes from filamentous ascomycetes ［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1995， 61：1323-1330.

［10］CARBONE I， KOHN L M. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes ［J］. Mycologia， 1999， 99：
553-556.

［11］GAO Lei， WANG Yuting， LI Zhi， et al. Gene expression changes during the gummosis development of peach shoots in response to Lasiodiplodia theobromae infection using RNA-Seq ［J/OL］. Frontiers in Physiology， 2016， 7：
170. DOI：
10.3389/fphys.2016.00170.

［12］YAN Jiye， XIE Yue， ZHANG Wei， et al. Species of Botryosphaeriaceae involved in grapevine dieback in China ［J］. Fungal Diversity， 2013， 61（1）：221-236.

［13］CROUS P W， SLIPPERS B， WINGFIELD M J， et al. Phylogenetic lineages in the Botryosphaeriaceae ［J］. Studies in Mycology， 2006， 55（55）：
235-253.

［14］王璠， 黃俊斌， 李国怀. 葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）引起的果树病害及研究进展［J］. 植物保护， 2013， 39（6）：
7-13.

［15］ESKALEN A. First report of Spencermartinsia viticola， Neofusicoccum australe， and N.parvum causing branch canker of citrus in California ［J］. Plant Disease， 2011， 95 （6）：
770.

［16］李其利， 黄穗萍， 郭堂勋， 等. 广西杧果流胶病菌的分子鉴定［J］. 植物保护学报， 2015， 42（4）：
669-670.

（责任编辑：田 喆）

猜你喜欢流胶病**南疆“吊干杏”产区流胶病发病因子研究绿色科技(2022年9期)2022-06-02浅析黄瓜流胶病害与细菌性流胶病今日农业(2022年1期)2022-06-01桃树流胶病及其防治方法研究进展世界热带农业信息(2021年2期)2021-05-29果树流胶病研究的进展与展望大连大学学报(2020年3期)2020-12-04武汉地区不同桃品种流胶病情况调查与评价落叶果树(2020年5期)2020-10-22避雨棚对南方桃流胶病的防治效果研究中国果菜(2018年11期)2018-12-05桃流胶病在湖北省发生的影响因子分析长江大学学报(自科版)(2018年22期)2018-12-03果树流胶病的研究进展山东林业科技(2017年6期)2017-04-05观赏桃抗流胶病的比较研究湖南农业科学(2016年8期)2016-09-24保护地黄瓜细菌性流胶病发生原因及防治对策新农业(2016年23期)2016-08-16

推荐访问:流胶病 病原菌 桃树