乙酸改性玫瑰茄花青素指示膜的制备及其在肉类新鲜度评价中的应用

孙 理，吴杨林，高 媛，孙巧歌，李春伟

（东北林业大学 工程技术学院，哈尔滨 150040）

花青素是一种酚类化合物［1］。近年来，以花青素作为新鲜度指示剂制备pH值敏感型智能包装成为研究热点［2］。其作为指示剂的主要原因是基于不同pH值条件下花色苷分子结构的改变［3］。MORADI等［4］基于细菌纳米纤维素和黑胡萝卜花青素制备了一种pH值指示膜。花青素之所以对腐败气体产生响应从而发生颜色变化是因为其中存在的酚类和共轭物质［5］。由于花色苷结构中含有多个羟基，很容易被氧气氧化逐渐降解为无色和棕色的物质［6］。但近年来有研究表明，酰基化改性可以提升花青素的稳定性［7］。LIU等［8］采取酶催化法用香豆酸和咖啡酸对蓝莓花青素进行酰化，以提高花青素的稳定性和抗氧化性。贾代涛等［9］利用乙酸作为酰化剂对花青素进行改性并应用于新鲜度指示。然而，前人的研究一方面没有说明酰化剂浓度对花青素复合膜颜色稳定性的影响；
另一方面改性后的花青素缺少新鲜度指示方面的应用。

本文利用乙酸酰化改性玫瑰茄花青素，将花青素浓缩液与乙酸溶液分别按 3种（2：1，1：2，1：1）不同的体积比混合，以结冷胶作为成膜基材，研究酰化剂浓度对花青素复合膜颜色稳定性的影响。并且通过研究指示膜的pH值响应、微观结构和物理性能，比较得到综合性能较好的薄膜，并将其应用到鸡肉的新鲜度指示中。

1.1 材料与试剂

玫瑰茄（农产品）购自哈尔滨市比优特超市；
结冷胶（分析纯，美国Sigma-Aldrich公司）；
1，1-二苯基-2-苦基（DPPH，美国Sigma-Aldrich公司）；
丙三醇、无水乙醇、冰乙酸等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

200T型高速多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；
90-4型数显控温磁力搅拌器（上海振捷实验设备有限公司）；
FA2004B型电子天平（上海舜宇恒科学仪器有限公司）；
RE52CS-2型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；
L6/L6S型紫外可见分光光度计（上海电科学仪器有限公司）；
NICOLET 6700型傅里叶变换红外光谱仪（美国 Thermo Fisher Scientific公司）；
X" Pert3 型PowedrX射线衍射仪（荷兰帕纳科公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 玫瑰茄花青素的提取

用粉碎机将烘干后的玫瑰茄粉碎，60目筛过滤后装入棕色瓶。称取一定量玫瑰茄粉末，按1：40比例与乙醇（50%）混合，在60 ℃水浴锅中浸提3 h，用布氏漏斗过滤。将花青素溶液在50 ℃下，用旋转蒸发仪去除乙醇，得到玫瑰茄花青素浓缩液。

1.3.2 玫瑰茄花青素的改性

参考文献［10］并进行改进。量取一定体积的花青素浓缩液，将其按一定比例（2：1，1：2，1：1）分别和乙酸溶液（1 mol/L）混合，在90 ℃的水浴环境中反应0.5 h，得到改性玫瑰茄花青素溶液。

1.3.3 指示膜的制备

指示膜用流延干燥法制备。称取1 g结冷胶粉末倒入100 mL去离子水中，磁力搅拌至全部溶解，制得1%质量分数的结冷胶溶液；
然后加入增塑剂丙三醇（结冷胶质量的80%）搅拌并降低温度至40 ℃；
再加入溶液质量20%的玫瑰茄花青素溶液，混合均匀后流延在培养皿中；
最后静置2～3 d后揭膜，制得样品1（未改性）、样品2（2：1）、样品 3（1：2）、样品 4（1：1）花青素 - 结冷胶指示膜。

1.3.4 指示膜的表征

（1）指示膜的FT-IR测试。傅里叶变换红外光谱仪对待测薄膜试样扫描测定，范围为4 000～500 cm-1，扫描 3 次［11］。

（2）X射线衍射。在40 kV电压下，采用多功能衍射仪对待测薄膜试样以5 °/min的速度进行5～60 °，15.4 nm 波长的扫描测试。

（3）指示膜的物理性能、含水率和水蒸气透过系数。分别在方形薄膜试样4个角和中心随机采集5个点，以5点的平均值作为薄膜总体厚度。参照GB/T1040.2—2006《塑料拉伸性能的测定》的方法，将薄膜裁剪成150×10 mm的标准试样，用拉力试验机对待测试样进行拉伸试验，拉伸速度：10 mm/min；
标距：40 mm，按照式（1）和（2）计算。

式中 σt ——待测薄膜试样的拉伸强度，MPa；

p —— 待测薄膜试样在拉伸断裂过程中的最大载荷，N；

b ——薄膜试样的宽度，mm；

d ——薄膜试样的厚度，mm；

ε ——薄膜试样的断裂伸长率，%；

x ——薄膜试样断裂时发生的位移，mm；

L0——薄膜试样的长度，mm。

裁取一定面积的薄膜试样，用电子天平称其质量记为M1（g），置于105 ℃鼓风干燥箱中烘干至恒重后取出，称其质量为M2（g），按下式计算薄膜含水率（MC），取薄膜3个平行试样的平均值作为薄膜的含水率。

参照文献［12］的方法并做一定的修改，测定薄膜的水蒸气透过系数。在100 mL的小烧杯中加入40 mL的蒸馏水，用待测薄膜试样包裹杯口并用细皮筋固定，置于22 ℃的干燥箱，每2 h称量1次，称6次，按照下式计算待测试样的水蒸气透过系数（WVP），每种薄膜取3个平行试样的平均值作为膜的水蒸气透过系数。

式中 Δm ——水蒸气透过的质量，g；

x ——待测薄膜的厚度，mm；

s —— 气体有效通过面积，22.9×10-4m2；

p ——22 ℃下膜两侧压强差，3 179 Pa；

t ——间隔时间，s。

（4）指示膜的光学性能。参照GB 2410—80《透明塑料透光率和雾度试验方法》并做适量调整，将薄膜置于透光率/雾度测定仪接收器处的窗口进行测定，每组薄膜分别在4个角和中心位置各测1次，取平均值。

（5）指示膜的稳定性测试。用色差仪测试薄膜L、a、b值后分别置于4 ℃和25 ℃环境保存，每4 h测量1次其颜色指标并按下式计算ΔE值。将薄膜试样置于室温下并用灯光照射，每2 h用色差仪测量其颜色指标计算ΔE值。

式中 L、a、b，L0、a0、b0—— 代表前后 2 次测量的颜色指标。

（6）抗氧化性测试。参照文献［12］的方法并作适当修改，测定薄膜的抗氧化性能。以无水乙醇作为溶剂，配置4 mg/100 mL的DPPH溶液，保存在棕色瓶中。将待测样品膜液按1：3的比例分别和DPPH溶液和无水乙醇混合，并将无水乙醇和DPPH按相同比例混合，室温下避光反应30 min，利用分光光度计分别测试3种混合液在517 nm处的吸光值，按照下式计算样品薄膜的自由基清除率：

式中 Y ——自由基清除率，%；

A1—— 待测薄膜样品膜液和自由基溶液的吸光度值；

A2—— 无水乙醇和自由基溶液的吸光度值；

A3—— 无水乙醇和待测薄膜样品膜液的吸光度值。

（7）指示膜在鸡肉新鲜度指示中的应用。参考文献［13］中的测试方法并作适当修改。将新鲜鸡肉切成形状相近、质量相等的块状，将指示膜裁成2×2 cm的小块覆盖在鸡肉上放入培养皿中，用保鲜膜将培养皿裹包放置于室温环境中，参考GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》，每隔6 h测试鸡肉的TVB-N值和pH 值［14］。

2.1 改性前后玫瑰茄花青素溶液与膜的pH值响应

玫瑰茄花青素改性前，当pH值为2时，溶液呈鲜红色，此时花青素主要以黄烊盐离子形式存在。随着pH值增加到5，其颜色逐渐变浅。pH值为6～8时，溶液由淡紫色变为淡蓝色，此时花青素分子主要由醌型碱组成。pH值为8～12时，溶液逐渐从棕黄色变成黄色。玫瑰茄花青素经改性后，溶液在不同pH值下的颜色依次为鲜红色（pH=2）→淡粉色（pH=5）→淡紫色（pH=6）→黄绿色（pH=8）→棕绿色（pH=10）→黄色（pH=12）。这与卢立新等［15］对改性玫瑰茄研究所得的结果不一致，可能是因为花青素来源和溶液的浓度不同以及pH值响应时间的差别。

改性前后样品2指示膜的颜色变化基本与溶液相同且改性后的花青素仍具有pH值响应。新鲜度指示型包装是将贮存过程中变化的生化指标转变为颜色的变化，通过颜色的变化可以直观反映出生鲜肉类的品质及新鲜程度，而改性玫瑰茄花青素仍具有较高的生理活性，其颜色变化可以作为判断食品新鲜度改变的指标［16］。

2.2 指示膜的红外光谱分析

从图1可以看出，样品1玫瑰茄花青素-结冷胶指示膜的红外吸收峰从左至右依次为3 280，2 930，2 887，1 787，1 733，1 606，1 027 cm-1［17］。

图1 指示膜的红外光谱图Fig.1 FT-IR spectra of intelligent indicator films

由文献［18］可知，红外光谱在3 700～3 000 cm-1波数范围内，由于-OH键的伸缩振动，出现强且宽的吸收峰，可能是因为花青素和甘油分子中含有羟基。在2 930 cm-1处的吸收峰归因于-CH3的伸缩振动，而2 887 cm-1位置的峰主要是由于-CH和-CH2的伸缩振动。1 787 cm-1处有1个强度较弱的肩峰，该峰是C-O-C的振动，是黄酮类化合物结构中呋喃环的伸缩振动吸收峰［19］。1 606 cm-1处是花青素的特征峰，即苯环与杂环骨架形成的芳香环架C=C振动。1 733 cm-1和1 150 cm-12处峰的强度在乙酸酰化改性后增强，分别与C=O和-OH的伸缩振动有关，其原因主要是酰化反应中酯基的生成以及乙酸中羟基的引入。在1 027 cm-1处呈现较强的特征峰归因于C-O-C的伸缩振动［20］。根据红外光谱图的分析，乙酸成功地酰基化改性玫瑰茄花青素。

2.3 指示膜的X射线衍射

XRD是评价薄膜样品结晶度的重要方法。从图2中可以看出，结冷胶在19.00 °和21.66 °出现宽衍射峰，表明结冷胶具有非晶态或半晶态结构［21］。一般来说，当复合材料的结晶组分和非结晶组分表现良好的相容性时，其结晶度要比单个组分的结晶度低。当添加玫瑰茄花青素后，没有出现新的衍射特征峰，并且特征峰强度有所降低，这意味着玫瑰茄花青素的加入降低薄膜聚合物的结晶度，改变薄膜的晶态结构，并且利用乙酸酰基化改性后没有影响到与结冷胶的相容性。

图2 基材及指示膜的X射线衍射图谱Fig.2 XRD of base material and intelligent indicator films

2.4 指示膜的力学性能、含水率以及水蒸气透过系数

表1为不同比例乙酸改性玫瑰茄-花青素结冷胶膜的厚度、力学性能、含水率以及水蒸气透过系数。改性后玫瑰茄花青素-结冷胶膜的拉伸强度有大幅度的提升，样品4的拉伸强度最大，为30.69 MPa；
样品3次之；
样品1的最小，为19.09 MPa。结冷胶与改性后花青素分子之间的相互作用是其力学性能增强的主要原因。改性后指示膜的断裂伸长率略微提升，含水率和水蒸气透过系数都有所降低，样品2指示膜的断裂伸长率为4.54 %，含水率为17.08%，水蒸气透过系数为 1.22×10-12g/（m·s·Pa），其原因可能是改性后缔合羟基数目的增多导致膜内各组分间作用力增强，从而形成致密的网状结构。

表1 指示膜的厚度、力学性能、含水率、水蒸汽透过系数Tab.1 Thickness，mechanical properties，water content and water vapor transmission coefficient of the indicator films

2.5 指示膜的光学性能

不同比例乙酸改性玫瑰茄花青素-结冷胶膜的透光率和雾度如表2所示。其中样品2，3，4指示膜的透光率不断提升，雾度也逐渐有所增大，说明用乙酸改性后的指示膜透明度更好，而包装薄膜对于雾度的要求是30 %，所以乙酸改性后指示膜可以应用到包装中。

表2 指示膜的透光率、雾度Tab.2 Light transmittance and haze of the indicator films （unit:%）

2.6 指示膜的稳定性

不同比例乙酸改性玫瑰茄-花青素结冷胶膜在4 ℃和25 ℃环境下存储过程中的颜色变化如图3（a）（b）所示。可利用贮存时的色差变化判断其在不同温度下的颜色稳定性［22］。

图3 不同条件下指示膜的颜色变化Fig.3 The color change of the indicator films under different exposure conditions

改性后的薄膜不论是在4 ℃还是在25 ℃下，其色差变化值较原膜都减小，热稳定性更好，这是因为花青素分子上的羟基经酰基化改性生成酯基，其活性降低，结构更加稳定，抑制花青素中不同结构间转变所引起的色差变化［23］。另外，薄膜在25 ℃下的色差变化均明显高于4 ℃，说明温度升高时，花青素的稳定性降低，这符合其他研究者对花青素温度稳定性研究所得出的结论：避光条件下，60 ℃以下温度更利于花青素的保存，且温度越高，越不利于保存［24］。这是因为高温有利于二苯基苯并吡喃阳离子向无色的假碱和查尔酮的转变，使得有颜色的琨式碱和黄烊盐离子减少，花青素颜色改变［25］。

不同比例乙酸改性玫瑰茄花青素-结冷胶膜在室温灯光照射的环境中放置6 h过程的颜色变化如图3（c）所示。色差ΔE的大小可作为其光稳定性的判断依据。改性花青素-结冷胶膜色差变化整体上均小于样品1，经改性后的稳定性得到一定程度的提高，这可能是酰基的引入抑制有色的黄烊盐离子变为无色假碱生成查尔酮或黄烊盐光解反应的进行。

2.7 指示膜的抗氧化性

由图4可以看出：随着乙酸比例的上升，改性后的指示膜的抗氧化性均有不同程度的下降。DPPH自由基清除率从大到小依次为样品1＞样品2＞样品4＞样品3。其原因可能是，花青素的抗氧化活性主要由于苯环上的-OH在酰化过程中，乙酸与花青素苯环上的-OH反应，随着酚羟基的减少，酰化花青素的抗氧化活性降低。另外，薄膜含水率、温度和微观结构等因素也都会影响其抗氧化活性成分的释出，进而影响抗氧化性能。

图4 指示膜的自由基清除率Fig.4 Free radical scavenging ability of intelligent indicator films

2.8 指示膜在鸡肉新鲜度指示的应用

综合改性后指示膜的各项性能，选取力学性能好、阻隔性强、颜色较为稳定的样品2应用于鸡肉的新鲜度指示。由图5可以看出，随着贮藏时间的延长，指示膜颜色有明显的变化，从开始的粉红色到24 h后的浅蓝色。贮藏期间，TVB-N值在0～18 h内增长平缓，参考国标GB2707-2016《鲜（冻）畜肉卫生标准》规定的每100 g新鲜鸡肉中TVB-N值应小于15 mg，此时6 h的鸡肉TVB-N的数值为15.33 mg/100 g，呈不新鲜状态［26］。另外鸡肉的初始pH值为5.55，贮藏6 h后为6.28，根据评定标准，当鸡肉pH值超过6.2时已经处于次新鲜状态，与TVB-N值评价结论一致。贮藏期超过18 h后，TVB-N值快速增大，说明鸡肉处于腐败状态。24 h时的TVB-N值为46.68 mg/100 g，pH值为7.83，指示膜颜色也变为浅蓝色。指示膜密切监测鸡肉腐败的全过程，从粉红色变为淡紫色，再到浅蓝色，通过肉眼就可以清晰地判别，该结论与蒋光阳等［27］发现玫瑰茄花青素在检测鱼肉新鲜度时指示膜由红色变为蓝色相似。结果表明，改性后的玫瑰茄花青素可以作为新鲜度指示剂，应用于肉类pH值变化指示新鲜度的改变。

图5 指示膜的颜色变化以及鸡肉在25 ℃贮藏期间的TVB-N值和pH值Fig.5 Color change of intelligent indicator films and TVB-N and pH values during storage of chicken

通过将乙酸与花青素以3种不同的比例混合改性，制成玫瑰茄花青素-结冷胶指示膜。对其pH值响应性、微观结构、力学性能、稳定性和新鲜度指示等特性研究分析，发现玫瑰茄花青素经改性后制得指示膜的力学性能、光学性和稳定性都有较大的改善，阻隔性也有所提升。其中FT-IR光谱表明乙酸成功酰化改性玫瑰茄花青素，并且XRD表明改性后玫瑰茄花青素不影响与结冷胶的相容性。拉伸强度最大的是样品4（30.68 MPa），断裂伸长率最大的是样品2（4.53%）。整体而言，改性后指示膜各项性能较好的是样品2，将其应用于监测鸡肉的新鲜度中，可以观察到在25 ℃贮藏期间，TVB-N和pH值都随时间的延长逐渐增大，指示膜颜色从粉红色变化到浅蓝色。用乙酸改性玫瑰茄花青素提升花青素的稳定性，将其制备成指示膜后也可用于指示鸡肉新鲜度的变化。

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