基于二茂铁标记适配体的电化学传感器检测玉米中黄曲霉毒素B1

朱冠宇，朱成喜，李玉叶，陈立兴，韩晓新

（1.江苏理工学院 电气信息工程学院，江苏 常州 213001；
2.江苏大学 农业工程学院，江苏 镇江 212013）

黄曲霉毒素B1（AFB1）是一种常见真菌毒素，主要由黄曲霉和寄生曲霉等霉菌产生，广泛存在于发霉的谷物及其制品中[1]。作为最危险的生物污染物之一，AFB1对人类具有强致癌性，被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物，已严重威胁到人类健康。AFB1在农产品和食品中被频繁检到，从而引起了全球关注[2]，因此，发展简便、灵敏、快速的AFB1检测技术对保障农产品和食品质量安全至关重要。目前，AFB1的检测方法主要有薄层色谱法[3]、高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）[4]、酶 联 免 疫 法[5]、荧 光分析法[6]等。例如，Andrade等人[7]利用低温液-液微萃取技术构建的HPLC和荧光光谱相结合的传感平台，可实现对牛奶中AFB1低至5 pg/mL的灵敏检测。利用上述分析技术可以实现对真菌毒素灵敏、可靠的检测，但是需要专业的操作人员，且仪器昂贵、分析成本高，因此难以在基层实验室或快速检测现场推广使用[8]。

电化学传感技术是一种利用待测物电化学性质，通过建立电信号与被测物浓度之间的线性关系进行检测的方法。与前述方法相比，电化学方法具有仪器简单、响应快、灵敏度高等优点，为构建新型真菌毒素检测方法提供了良好的基础[9-10]。传统的电化学传感器主要利用待测物在修饰材料的电极表面发生氧化还原反应的特性，根据产生的电流大小检测目标物浓度，体系的选择性较差[11]。为了提高电化学传感器的灵敏度和选择性，研究人员对适配体开展了深入的研究。适配体是一种人工合成的单链DNA或RNA，对靶标具有高特异性亲和力。适配体的结构多样，可形成发夹、假结、凸环、G-四联体等复杂空间结构，与目标分子发生类似抗原-抗体反应的构象识别[12]。相较于抗体，除了亲和力高、特异性强等特点外，适配体还具有靶标范围广、筛选周期短、成本低、稳定性好、便于修饰等优点。利用适配体作为识别元件的电化学传感器，可以获得更高的检测灵敏度和选择性，在真菌毒素检测领域具有巨大应用潜力[13]。

在电化学适配体传感策略中，为了获得针对目标物的电响应信号，往往需要加入与DNA（适配体）或纳米材料有特殊亲和力的电活性小分子作为氧化还原探针，如亚甲基蓝（MB）、二茂铁（Fc）、硫堇（Thi）等[14-15]。利用电化学探针标记适配体或互补DNA，通过目标诱导电极表面DNA的构象变化，改变探针与电极表面的距离（距离调控策略），或目标物加入后产生的位阻变化，导致探针电化学特征的变化（位阻效应策略），实现目标物的电化学适配体传感[16]。Yuan等人[17]利用互补DNA与Thi修饰DNA/AuNPs纳米复合物来放大Thi的电流信号，构建的电化学适配体传感器对miRNA的检出限低至11 amol/L。上述研究为检测AFB1提供了新的、有效的方法和途径。

本文提出了一种基于二茂铁标记适配体的电化学适配体传感器，用于灵敏检测玉米中的AFB1。该传感器通过在金电极上顺序组装巯基化互补DNA（cDNA）、巯基己醇（MCH）、二茂铁修饰AFB1适配体（Fc-Apt）形成基于双链DNA结构的传感界面。当AFB1存在时，其与适配体的特异性结合导致Fc-Apt从电极上释放，使IFc降低，从而实现对AFB1的灵敏检测。该传感器具有较高的灵敏度和选择性、良好的重现性和稳定性，可成功应用于对玉米中AFB1的检测。

1.1 试剂与药品

氯化钾、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾和亚铁氰化钾（均为国药试剂）；
6-巯基己醇（Adamas公司）；
羟甲基氨基甲酸（Tris）（Alfa Aesar公司）；
黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2（AFB2）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和伏马菌素B1（FB1）（均为Aladdin试剂）。本研究所用的试剂均为分析纯，所用水均为超纯水。适配体和DNA链由生工生物公司提供，序列如表1所示。

表1 适配体和DNA链的序列

1.2 仪器设备

所有电化学测量，包括循环伏安（CV）、交流伏安（ACV）、电化学阻抗谱（EIS），均在CHI660E电化学工作站（上海辰华）进行。

1.3 电化学测量

所有的电化学测量均在室温下使用三电极体系进行。以铂丝为对电极，Ag/AgCl（饱和KCl）为参比电极，金电极（AuE，直径3 mm）为工作电极。EIS测量是在含有5 mmol/L Fe（CN）63-/4-的0.1 mol/L KCl中进行，频率范围为0.1 Hz～10 kHz，直流电压为0.25 V。使用ZSimpWin软件基于Randles等效电路，对阻抗数据进行拟合。ACV测量是在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中进行，扫描电位为0.2～0.7 V、阶跃电位为4 mV、频率为25 Hz、振幅为25 mV。

1.4 传感器的构建及检测机理

该传感器的构建过程如图1所示，步骤如下：首先，将6 μL的cDNA溶液滴加到Au电极上，室温下放置6 h，使cDNA通过Au-SH键组装在AuE电极表面；
其次，将所得电极在1 mmol/L的MCH中浸泡1 h，以阻断Au的特异性结合位点；
然后，滴 加6 μL的Fc-Apt溶 液，孵 育1 h，利 用DNA杂交将Fc-Apt组装于电极表面，用Tris-HCl缓冲液洗涤后，得到AFB1适配体传感器，记为AuE/cDNA/MCH/Fc-Apt。

图1 电化学AFB1适配体传感器的构建和检测示意图

为了检测AFB1，将上述传感器浸泡在AFB1溶液中孵育一定时间，然后用Tris-HCl缓冲液洗涤后进行ACV测量。ACV测量过程如下：以上述洗涤后的电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl（饱和KCl）为参比电极，在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，以扫描电位0.2～0.7 V、阶跃电位4 mV、频率25 Hz、振幅25 mV进行ACV测量。传感器的检测机理如下：目标物AFB1加入后，其与适配体的特异性识别导致Fc标记适配体（Fc-Apt）从电极表面剥离，随着Fc在电极表面吸附量的降低，Fc的氧化电流（IFc）降低；
通过测量标准浓度AFB1溶液的电流信号IFc，建立AFB1浓度对应IFc的标准线性曲线；
将所测得的IFc代入标准线性曲线，实现对AFB1的电化学灵敏检测。

1.5 实际样品处理

玉米样品采购自本地超市（江苏常州）。样品的处理过程如下[18]：首先，玉米经粉碎机粉碎后，加入一定量的AFB1标准溶液，室温下干燥6 h；
其次，将10 mL甲醇-水混合液（体积比6∶4）添加到处理过的样品中，震荡2 h后，以8 000 rpm将混合物离心10 min，上清液使用过滤器（0.22 μm）过滤；
最后，用Tris-HCl缓冲液将所得溶液稀释为1、2、5、10 ng/mL四个样本，并在4℃冰箱中保存备用。

2.1 传感器的电化学表征

使用EIS技术对AFB1传感器的构建和目标识别过程进行了研究。EIS结果用Nyquist图表示，并使用Randles等效电路进行了拟合，见图2。拟合参数包括电解质溶液电阻（Rs）、常相角元件（Q）、电荷转移电阻（Ret）和扩散电阻（Zw）。其中，Ret反映了氧化还原探针在电极界面的电荷转移动力学，其阻值可以通过计算Nyquist图的半圆直径来估算。如图2所示，Au电极的Ret值（曲线a）为90 Ω，表明其良好的导电性。随后，cDNA/AuE的Ret值显著增加到1 924 Ω（曲线b），表明cDNA已成功固定在Au电极上，阻碍了氧化还原探针与电极之间的电子传递。使用MCH封闭Au非特异性位点后，Ret增加到2 407 Ω（曲线c）。Fc-Apt加入后，Ret进一步增加到2 656 Ω（曲线d），表明Fc-Apt已在电极表面组装。加入目标物AFB1后，电极的Ret降低到2 264 Ω（曲线e），表明目标物与适配体之间的特异性识别导致Fc-Apt从传感器表面解离。以上EIS结果表明，该电化学适配体传感器已经构 建成功。

图2 不同修饰电极的EIS响应曲线

为了验证所构建传感器用于AFB1检测的可行性，测量了传感器对不同浓度AFB1的ACV响应。如 图3所 示，Fc-Apt/MCH/cDNA/AuE电 极在+0.42 V处有明显Fc氧化峰（曲线a），其峰值电流为2.92 μA。当AFB1存在时，其与适配体的特异性识别导致Fc-Apt从电极表面解离，IFc降低；
AFB1浓度为0.1 ng/mL时，IFc值为2.6 μA（曲线b）；
而当AFB1浓度为1.0 ng/mL时，IFc值降低为2.37 μA（曲线c）。以上结果证实了该适配体传感器用于检测AFB1的良好可行性。

图3 传感器检测AFB1的可行性

2.2 实验条件优化

为了获得最优的信号响应，对传感器制备和AFB1检测过程中的实验条件进行了优化。电极上的Fc组装量会严重影响电化学传感器的检测灵敏度，而Fc的组装量依赖于Fc标记的cDNA的浓度。如图4（a）所示，随着AFB1的加入cDNA的浓度不断增大，ΔIFc先快速增大，在cDNA浓度为2.4 μmol/L时达到峰值，然后有所下降。这是由于cDNA浓度的增加会引起空间位阻和静电排斥，导致cDNA在电极表面形成发夹结构的能力下降。因此，适宜选用2.4 μmol/L的cDNA构建适配体传感器。

AFB1与适配体反应的孵育时间是适配体传感器的另一个重要参数。如图4（b）所示，随着孵育时间的增加ΔIFc的值开始快速增加，但40 min后无明显变化。说明40 min足以进行AFB1检测时的特异性识别。因此，选择40 min作为检测AFB1的最佳孵育时间。

图4 构建传感器的实验条件优化

2.3 传感器的分析性能

在最优实验条件下，对该适配体传感器检测AFB1的分析性能进行了评估。如图5所示，随着AFB1浓度增大，IFc逐渐降低，表明可以用IFc的值来表征AFB1的浓度。图6给出了IFc与AFB1浓度对数的线性回归曲线。可知，传感器对AFB1的线性响应范围为1.0 pg/mL～1.0 μg/mL，检出限为0.33 pg/mL，线性回归方程 为IFc=0.228-0.145 LogCAFB1，相 关 系 数（R2）为0.995。

图5 传感器对不同浓度AFB1的ACV响应曲线

图6 传感器检测AFB1的线性回归曲线

表2列出本文构建的传感方法与已报道的AFB1检测方法的对比。结果表明，与HPLC-MS[4]、比色法[19]、荧光[6]、电化学发光[20]等检测方法相比，本文构建的适配体传感器具有更低的检出限。与电化学DPV（基于丝网印刷电极）[22]、电化学阻抗EIS（基于MWCNTs/RTIL修饰玻碳电极）[23]等方法相比，本文构建的适配体传感器具有相当或更低的检出限，表明该传感器具有优越的分析性能。

表2 本研究构建的传感方法与已报道的AFB1检测方法分析性能对比

2.4 传感器的选择性、重现性和稳定性

为了评估该传感器的选择性，使用一些常见真菌毒素进行了干扰实验，干扰物包括OTA、FB1、ZEN和AFB2。其中，AFB1浓度为10 ng/mL，干扰物浓度均为100 ng/mL。如图7所示，对干扰物的响应几乎与背景信号相同，只有AFB1能引起明显的电流响应。结果表明，该适配体传感器对AFB1具有良好的选择性。

图7 传感器对AFB1与AFB2、ZEN、OTA、FB1的响应对比

此外，使用6根不同传感电极检测相同浓度的AFB1（1ng/mL），以评估传感器的重现性。由图8可知，6组测试结果的相对标准差（RSD）为2.0%，表明传感器具有较高的重现性。此外，我们还研究了该适配体传感器的稳定性，见图9。在4℃冰箱中储存后，传感器对AFB1响应的相对标准偏差为5.3%，表明传感器具有较满意的稳定性（7 d）。

图8 传感器6次平行测量1 ng/mL AFB1的重现性

图9 传感器的7 d稳定性

2.5 实际样品分析

将该传感方法应用于玉米样品中AFB1的检测，以验证该方法的实用性。表3列出了该传感方法对玉米样品中AFB1进行检测的结果。可知，该传感方法对AFB1检测的回收率为93.0%～102.5%。相对较低的RSD表明，该方法用于实际样品检测具有较高的实用性。

表3 玉米样品中AFB1的检测结果

本文设计了一种基于二茂铁标记适配体的电化学适配体传感器，用于灵敏检测玉米中的AFB1。适配体的引入提高了电化学传感的选择性，电化学探针Fc的引入提高了传感器的灵敏度。该传感策略结合了电化学检测与基于DNA构象变化的开关探针的优点，因而构建的传感器具有较高的灵敏度和选择性。其对AFB1的线性检测范围为1.0 pg/mL～1.0 μg/mL，检出限低至0.33 pg/mL。此外，还将该传感器应用于加标玉米样品中AFB1的检测，结果回收率为93.0%～102.5%，RSD低于4.6%，表明具有较好的实用性。通过改变目标物的适配体，该策略可以很容易地拓展到对各种生物分子的检测，具有很好的应用潜力。

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