循环微小RNA-188-5p在冠状动脉造影术后对比剂肾病的预测价值

左智，于然，陈皓瑜，李庆菊，宋坚，陈佳佳，王万鹏,3

对比剂肾病（CIN）又称造影剂肾病，是含碘造影剂引起的急性肾损伤，现已成为心内科冠状动脉（冠脉）造影和介入治疗的主要并发症之一[1]。CIN导致患者发生心血管事件风险和肾脏损伤几率明显增高，因此对CIN的早期诊断和治疗至关重要。目前临床通过检测造影剂暴露后72 h内血肌酐（SCr）的升高对CIN进行诊断[2]。但SCr并非CIN诊断的良好指标，一方面是由于SCr易受患者年龄、代谢和蛋白质摄入等因素影响，导致其特异性不足；
另一方面SCr通常在造影剂暴露后48～72 h增高，具有滞后性，不利于CIN的早期发现[3]。因此需要寻找特异性强反应灵敏的新标志物，进一步了解其发生机制。

既往研究显示微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性单链非编码RNA，其具有组织特异性和疾病特异性等特点。血液中的miRNA又称为循环miRNA，主要存在于囊泡中，可以抵抗RNA酶的降解，因此可长时间稳定存在。研究证实血液、尿液等体液中miRNA分子在室温放置24 h后反复冻融8次仍可保持稳定[4]。既往研究表明微小RNA-188-5p（miR-188-5p）通过靶向SRSF7增强造影剂诱导的急性肾损伤大鼠模型和肾小管上皮细胞凋亡[5]。在本研究中，我们探究循环miR-188-5p对接受冠脉造影术患者术后发生CIN的早期预测能力。

1.1 miR-188-5p在CIN大鼠模型中的表达从GEO（Gene Expression Omnibus， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）数据库获得GSE81400和GSE130796表达矩阵及平台信息。数据集GSE81400包含16个样本的miRNA表达谱信息，样本分别是4例CIN大鼠模型中的血浆miRNA信息及4例对照，4例CIN大鼠模型中的肾脏miRNA表达谱信息及4例对照组，其中血浆及肾脏组织收取于造影剂暴露8 h后[6]。数据集GSE13079基于平台GPL18694，包含3例CIN大鼠肾脏组织miRNA表达谱及3例对照信息。其中肾脏组织取自于造影剂暴露12 h[7]。提取两组数据集中miR-188-5p表达信息用于下游分析。

1.2 临床资料及血浆收集选取2020年6月至2020年12月于南京医科大学第一附属医院心血管内科行冠脉造影（CAG）和/或冠脉介入治疗（PCI）并发CIN患者。另按照1:3比例纳入同时期无并发CIN的患者作为对照组。CIN组纳入标准：患者造影剂暴露后冠脉造影术后24～72 h内SCr增高≥44.2 μmol/L或较基础值升高≤25%。排除标准：近期存在造影剂暴露；
服用过具有肾毒性药物或其他原因导致的肾损伤；
合并恶性肿瘤患者、造影剂过敏及依从性差者。收集患者术前及造影剂暴露后12 h血液样本，常温放置0.5 h后，经3000 rpm/min，15 min离心，取上清于EP管中，放入-80℃冰箱待用。本研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会审批通过。

1.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）200 μl血清标本用于miRNA检测，采用美国Qiagen公司miRNeasy血清/血浆miRNA柱式提取试剂盒，具体步骤按照产品说明书。最终将血清中RNA产物溶解于12 μl焦碳酸二乙酯（Diethy pyrocarbonate，DEPC）处理过的双蒸水中。使用基于颈-环结构特异性反转录引物的Taqman探针（ThermoFisher，美国）法检测循环miR-188-5p的表达量，具体操作步骤见说明书[8]。PCR扩增包括：TaqMan™ Small RNA Assay （20X）0.5 μl、PCR Master Mix 5.00 μl cDNA模板0.67 μl，补无RNA酶水至10 μl。反应条件为先进行1个循环：95 ℃ 10 min；
接下来进行40个循环：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s。使用U6作为内参对miRNA的表达进行标准化。2-ΔΔCt法用于计算循环miR-188-5p相对表达量。

1.4 统计学分析统计学分析使用SPSS 26.0软件，数据可视化处理使用GraphPad Prism 5软件。计量资料以平均数±标准差（±s）表示，levene法检测方差齐性，两组间比较使用t检验。计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验。受试者工作曲线（ROC）曲线分析循环miR-188-5p预测患者发生CIN的敏感度和特异度。Logistic单因素分析可能与CIN相关的危险因素，对上述经单因素分析显示P＜0.01及有临床意义的因素进行多因素Logistic回归分析，得出CIN的独立危险因素，以比值比（OR）表示风险的程度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 miR-188-5p在对比剂肾损伤大鼠中血清及肾组织中的表达分析GEO数据库中数据集GSE81400，结果显示CIN大鼠血浆中[（1.116±0.034） vs. （1.00±0.031），t=4.344，P=0.005]图1A，及肾脏中[（1.860±0.309） vs. （1.00±0.051），t=4.751，P=0.003]，图1B，的miR-188-5p表达高于对照组；
分析数据集GSE130796结果显示，CIN大鼠肾脏中的miR-188-5p表达高于对照组[（2.360±0.317） vs. （1.00±0.497）]，差异有统计学意义（t=3.256，P=0.031），见图1C。

图1 生物信息学分析miR-188-5p在CIN大鼠中的表达量

2.2 入组研究对象基线临床资料共收集CIN患者42例及另126例无并发CIN的患者作为对照。两组患者的术前一般临床资料如表1所示，两组患者间性别、SCr值、血尿素氮（BUN）、尿酸、高血压、贫血、高脂血症、他汀类、β受体拮抗剂、钙离子拮抗剂、ACEI/ARB药物使用情况及miR-188-5p表达量无显著差异（P均＞0.05）。CIN组患者年龄（67.7±9.7 vs. 64.2±9.5，t=2.047，P=0.042）、糖尿病发生率（52.4% vs. 26.2%，χ2=9.812，P=0.002）、贫血发生率（21.4% vs. 9.5%，χ2=4.082，P=0.043）、造影剂用量（126.4±28.6 vs. 117.1±21.8，t=2.190，P=0.030）高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 患者基线临床资料

2.3 miR-188-5p在CIN中的诊断价值进一步对两组患者造影剂应用后12 h的循环miR-188-5p的表达情况进行检测，结果显示，而在造影剂应用12 h后，CIN患者组的循环miR-188-5p表达水平显著高于对照组患者[（1.852±0.890） vs. （1.266±0.537），t=4.029，P＜0.001]，图2A。ROC曲线用于分析循环miR-188-5p在CIN中的早期诊断价值，结果如图2所示， ROC曲线下面积（AUC）为0.704，以循环miR-188-5p相对表达量1.825为截点，其对于诊断CIN诊断的敏感性为45.24%，特异性为88.89%，见图2B。

图2 术后miR-188-5p在CIN中的诊断价值

2.4 CIN危险因素分析将年龄、性别、血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）、合并高血压、糖尿病、造影剂用量、是否应用他汀类、β受体阻滞剂等临床资料进行单因素Logistic回归分析，结果显示年龄（OR=1.040，P=0.044）、合并糖尿病（OR=3.100，P=0.002）、贫血（OR=2.591，P=0.049）、造影剂用量（OR=1.016，P=0.033）及术后miR-188-5p表达量（OR=3.467，P＜0.001）与CIN间有统计学关联。多因素分析显示年龄（OR=1.016，P=0.033）、糖尿病（OR=3.582，P=0.004）、造影剂用量（OR=1.026，P=0.004）及术后miR-188-5p表达量（OR=2.835，P=0.001）与CIN密切相关，具有预测价值，表2。

表2 与CIN有关指标的Logistic回归分析

影像和介入的进步促进了造影剂的应用，但也使CIN的发生不断升高。目前CIN占住院患者获得性AKI病因的第三位[9]，不仅延长患者住院时间、增加住院费用，还增加了心脏不良事件发生率，造成更高的院内及远期死亡率[10,11]。对于CIN目前尚无有效治疗方法，因此预防为主[12]。

由于部分循环miRNA是存在于微囊泡中的，这种存在方式可以使其抵抗极端条件，如PH值变化、反复冻融等条件，且有效抵制血液中存在的RNA酶的降解，因此循环miRNA有望成为新型微创生物标志物[13]。越来越多的研究揭示出不同的循环miRNA在各种急慢性肾损伤疾病中的诊断及预测作用。近期研究表明血清 miR-10a表达水平对重症急性胰腺炎[14]患者以或脓毒血症患者[15]是否并发急性肾损伤的具有重要的预测价值。而在CIN的研究中，人们通过各种芯片技术发现动物模型中的血液和肾脏组织早期便存在大量miRNA的表达异常[6,7]，因此循环miRNA具有潜力作为生物标记物为CIN的发生提供早期诊断。在本研究中，我们分析公共数据库及检测临床样本，不仅发现CIN大鼠在造影剂暴露8～12 h便存在血液及肾脏miR-188-5p的表达异常，同时通过临床样本证实在造影剂暴露12 h后，并发CIN的患者循环miR-188-5p表达增高，对于CIN的发生具有预测价值，其反应速度较传统标志物更快，可能比传统的CIN标记物更具有优势。

肾小管是肾脏重吸收的重要部位，也是造影剂损伤的主要部位，因此CIN的基本病理变化是急性肾小管坏死，表现为肾小管上皮细胞严重颗粒和空泡变性，进而崩解脱落。对比剂对肾小管上皮细胞的毒性损伤机制极其复杂，主要包括肾灌注血流量减少、氧自由基作用、炎症免疫，最终导致肾小管上皮细胞凋亡或坏死等[16,17]，但目前学界公认，线粒体功能障碍引起的活性氧（ROS）增多是肾小管上皮细胞损伤的使动因素。作为一种氧化应激相关miRNA，多个研究显示miR-188-5p在细胞凋亡、细胞存活和氧化应激损伤的调控中起着重要分子作用[18]。研究表明，在高糖诱导的肾小管上皮细胞系HK-2氧化应激损伤时，升高的miR-188-5p通过抑制PTEN进而促进HK-2细胞上皮间质转分化过程（EMT）。而在人神经细胞系HNC细胞氧糖剥夺-复糖复氧模型中，miR-188-5p则通过调控PTEN表达参与神经元凋亡的调节。在本研究中，我们不仅发现CIN发生后伴随血液和肾脏组织中升高的miR-188-5p，同时，通过单因素和多因素Logistic回归分析显示循环miR-188-5p是发生CIN的独立危险因素，因此考虑造影剂暴露后伴随升高的miR-188-5p来自于肾脏组织可能性较大，其不仅是生物标记物的存在，同时可能参与了CIN疾病的发生发展，但需进一步通过体外及体内实验加以验证。

利益冲突：本文所有作者均声明不存在利益冲突。

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