三阴性乳腺癌组织长链非编码RNA-P21、microRNA-17-3p的表达及其临床意义*

刘凡，施文瑜，刘益飞，王国华

（南通大学附属医院 1.肿瘤化疗科，2.病理科，江苏 南通 226001；
3.南通大学特种研究所，江苏 南通 226001）

三阴性乳腺癌占全部乳腺癌的10%～20%，侵袭性强、转移率高，且临床治疗机会和时间窗有限，术后易复发，生存率较低[1]。长链非编码RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是长度大于200个核苷酸且不具编码蛋白质功能的RNA，但可调节mRNA、microRNA的活性和稳定性，在转录后发挥作用，几乎参与细胞的所有生理活动，与膀胱癌、结直肠癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发病和恶性进展有关[2]。LncRNA-P21是P53依赖性转录靶基因，参与细胞周期调控、代谢和重编程，与癌症进展相关[3]。MicroRNA-17-3p（miR-17-3p）是一种致癌microRNA。有研究发现，miR-17-3p在多发性骨髓瘤中通过抑制LMLN基因下调P21表达，促使肿瘤细胞增殖[4]。本研究拟检测三阴性乳腺癌组织中LncRNA-P21、miR-17-3p的表达，分析其与三阴性乳腺癌患者的临床病理特征及预后的关系，以期为三阴性乳腺癌的治疗和预后提供参考。

1.1 临床资料

选取2016年1月—2017年5月南通大学附属医院收治的106例三阴性乳腺癌患者经手术切除的癌组织和癌旁组织（距离癌组织至少5 cm）标本及患者的临床资料。年龄51～65岁，平均（55.23±7.31）岁；
乳腺肿块直径0.62～3.56 cm，平均（2.58±0.34）cm；
分化程度：低、中度分化65例，高度分化41例；
临床分期：Ⅰ、Ⅱ期72例，Ⅲ期34例；
腋窝淋巴结转移31例，绝经43例；
细胞增殖指数Ki-67阳性表达（≥ 30%）71例。纳入标准：①术后病理提示免疫组织化学染色雌激素受体、孕激素受体阴性，荧光原位杂交提示人表皮生长因子受体2阴性，人表皮生长因子受体2/Neu基因无扩增；
②病理资料完整，接受随访；
③年龄≥ 18周岁。排除标准：①术前接受化疗、放疗、免疫等任何形式的抗肿瘤治疗；
②术前已经发生远处转移或此次因复发再次住院治疗的患者；
③Luminal型、Her-2型、basal-like型等其他类型乳腺癌。本研究已经获得医院医学伦理委员会批准[通大伦理（2018）20号]。

1.2 实时荧光定量聚合酶链反应检测LncRNAP21、miR-17-3p表达

取手术切除的癌组织和癌旁组织石蜡标本，二甲苯脱蜡，无水乙醇脱二甲苯，选取100 mg匀浆研磨，离心弃上清液。TRIzol法（美国Invitrogen公司）提取总RNA，用紫外分光光度计（美国NanoDrop公司）分别在260 nm和280 nm处检测吸光度，260/280 nm吸光度比值为1.8～2.0，取该比值区间的RNA进行后续实验，采用M-MLV逆转录酶（美国Epicentre公司）逆转录为cDNA，反应条件：15℃ 30 min，45℃ 30 min，85℃ 5 min 灭 活。CFX96实时荧光PCR仪，美国Bio-Rad公司。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测LncRNA-P21、miR-17-3p表达，反应体系：
cDNA 1 μL，正反向引物0.4 μL，2×TransTaq®Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Reference Dye（50×）0.4 μL，最后添加ddH2O至20 μL；
反应条件：50℃预变性2 min，97℃变性20 s，60℃退火20 s，70℃延伸15 s，共40个循环。引物序列由宝生物工程（大连）有限公司设计：LncRNA-P21正向5"-CCACATTGCTGTTCATCAC C-3"，反 向5"-TGAGCAAGCTAGTGGAAGCA-3"，引物长度20 bp；
miR-17-3p正向5"-TGCGTTGACGTC ACTCCCG-3"，反 向5"-GTGCAGGGTCCGAGGT-3"，引物长度18 bp；
U6正向5"-CTCGCTTCGGCAGCAC A-3"，反向5"-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3"，引 物长度19 bp。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相对表达量。

1.3 随访

所有患者接受术后5年的电话或门诊复查随访，统计无病生存期（DFS）、总生存期（OS）及预后。DFS定义为手术日至首次出现疾病复发或远处转移的时间，OS定义为手术日至或因疾病进展或其他任何原因引起死亡的时间。无复发、转移和死亡为预后良好，复发、转移和死亡为预后不良。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；
相关分析用Pearson法；
Kaplan-Meier法绘制生存曲线，比较用Log rank χ2检验；
影响因素的分析用单因素或多因素Cox回归模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 癌组织和癌旁组织LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相对表达量比较

癌组织与癌旁组织LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相对表达量比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），癌组织LncRNA-P21 mRNA相对表达量低于癌旁组织，癌组织miR-17-3p mRNA相对表达量高于癌旁组织。见表1。

表1 癌组织和癌旁组织LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相对表达量比较 （n =106，±s）

表1 癌组织和癌旁组织LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相对表达量比较 （n =106，±s）

组别癌组织癌旁组织t 值P 值LncRNA-P21 mRNA 0.85±0.19 1.86±0.32 27.941 0.000 miR-17-3p mRNA 3.84±0.76 1.75±0.41 24.918 0.000

2.2 不同临床病理特征三阴性乳腺癌组织LncRNA-P21和miR-17-3p mRNA相对表达量的比较

不同临床分期、腋窝淋巴结转移、Ki-67表达三阴性乳腺癌组织LncRNA-P21、miR-17-3p mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
临床Ⅲ期、有腋窝淋巴结转移、Ki-67≥ 30%三阴性乳腺癌组织LncRNA-P21 mRNA相对表达量低于临床Ⅰ、Ⅱ期，无腋窝淋巴结转移和Ki-67＜ 30%；
临床Ⅲ期、有腋窝淋巴结转移、Ki-67≥ 30%三阴性乳腺癌组织miR-17-3p mRNA相对表达量高于临床Ⅰ、Ⅱ期，无腋窝淋巴结转移和Ki-67＜30%。不同年龄、肿瘤直径、分化程度、绝经状态LncRNAP21、miR-17-3p mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同临床病理特征三阴性乳腺癌组织LncRNA-P21和miR-17-3p mRNA相对表达量的比较 （±s）

表2 不同临床病理特征三阴性乳腺癌组织LncRNA-P21和miR-17-3p mRNA相对表达量的比较 （±s）

临床病理特征年龄≤ 60岁＞ 60岁肿瘤直径≤ 2 cm＞ 2 cm分化程度低、中度高度临床分期Ⅰ、Ⅱ期Ⅲ期腋窝淋巴结转移有无绝经是否Ki-67≥ 30%＜ 30%n 63 43 48 58 65 41 72 34 31 75 43 63 71 35 LncRNA-P21 mRNA 0.84±0.14 0.87±0.13 0.88±0.12 0.83±0.14 0.84±0.13 0.87±0.12 0.91±0.09 0.72±0.06 0.77±0.08 0.88±0.12 0.88±0.11 0.83±0.16 0.79±0.13 0.97±0.07 t 值1.115 1.951 1.191 11.178 4.685 1.781 7.651 P 值0.268 0.054 0.236 0.000 0.000 0.078 0.000 miR-17-3p mRNA 3.81±0.79 3.89±0.62 3.76±0.69 3.91±0.58 3.93±0.52 3.70±0.80 3.67±0.29 4.21±0.33 4.42±0.18 3.60±0.21 3.90±0.70 3.80±0.79 4.12±0.44 3.27±0.18 t 值0.557 1.216 1.795 8.557 19.030 0.670 10.964 P 值0.579 0.227 0.076 0.000 0.000 0.505 0.000

2.3 LncRNA-P21与miR-17-3p的相关性

Pearson相关性分析结果显示，三阴性乳腺癌组织的LncRNA-P21表达与miR-17-3p表达呈负相关（r=-0.570，P=0.000）。见图1。

图1 LncRNA-P21与miR-17-3p相关性的散点图

2.4 不同LncRNA-P21、miR-17-3p表达三阴性乳腺癌患者的生存分析

随访期间，106例患者复发11例，远处转移14例，死亡17例。以三阴性乳腺癌组织LncRNA-P21 mRNA相对表达量的均值0.85为临界值，分为高表达组和低表达组；
LncRNA-P21低表达组的5年DFS、OS生存率低于LncRNA-P21高表达组（χ2=4.952和3.900，P=0.014和0.029）。以三阴性乳腺癌组织miR-17-3p mRNA相对表达量的均值3.84为临界值，分为高表达组和低表达组；
miR-17-3p高表达组的5年DFS、OS生存率低于miR-17-3p低表达组（χ2=4.782和3.873，P=0.019和0.031）。见图2。

图2 不同LncRNA-P21、miR-17-3p表达三阴性乳腺癌患者的生存曲线

2.5 影响三阴性乳腺癌患者预后的因素分析

以三阴性乳腺癌患者预后为因变量（0 =预后良好，1 =预后不良），以年龄（0 = ≤ 60岁，1 = ＞60岁）、肿瘤直径（0 = ≤ 2 cm，1 = ＞ 2 cm）、分化程度（0 =高度分化，1 =低、中度分化）、临床分期（0 =Ⅰ、Ⅱ期，1 =Ⅲ期）、腋窝淋巴结转移（0 =无，1 =有）、绝经（0 =否，1=是）、Ki-67（实测值）、LncRNA-P21（实测值）、miR-17-3p（实测值）为自变量，纳入单因素Cox回归模型，结果显示，分化程度、临床分期、腋窝淋巴结转移、LncRNAP21、miR-17-3p是三阴性乳腺癌患者预后的影响因素（P＜0.05）（见表3）。将分化程度、临床分期、腋窝淋巴结转移、LncRNA-P21、miR-17-3p纳入多因素Cox风险比例回归模型，α入=0.05、α出=0.10，结果显示，腋窝淋巴结转移、miR-17-3p为三阴性乳腺癌患者预后不良的危险因素（P＜0.05），LncRNA-P21为保护因素（P＜0.05）（见表4）。

表3 影响三阴性乳腺癌患者预后的单因素Cox回归模型参数

表4 影响三阴性乳腺癌患者预后的多因素Cox风险比例回归模型参数

三阴性乳腺癌是一种高度侵袭性的乳腺癌亚型，与其他病理类型的乳腺癌相比，三阴性乳腺癌往往发病年龄更小，组织学分级更高，肿瘤体积更大，复发和远处转移倾向更大，预后更差[5-6]。目前尽管分子靶向、免疫在乳腺癌治疗中取得了较大的进展，但是对三阴性乳腺癌患者来讲，上述治疗方案并未能显著提高患者的生存率，即便是早期三阴性乳腺癌患者化疗后缓解，但仍可能复发和转移，而发生转移性病变患者的总生存期仅13～18个月[7]。非编码RNA约占人类DNA的98%，在表观遗传调控，染色质修饰、转录和翻译等发挥关键作用，与癌症发生和进展密切相关。非编码RNA主要包括LncRNA和miRNA。其中，miRNA是22 nt长的非编码RNA，主要通过与靶标mRNA的3"非翻译区的靶位点结合诱导基因转录。LncRNA是miRNA的前体，通过调节miRNA表达调控RNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等[8]。有研究发现LncRNA和miRNA失调均与乳腺癌发生及预后有关[9]。

LncRNA-P21是一种新的细胞增殖和凋亡的调节因子，位于17号染色体，作为P53的直接转录靶标，LncRNA-P21可通过直接与E3泛素蛋白连接酶结合，导致P53从E3泛素蛋白连接酶中释放并与P300结合继而增强P53的活性，从而调节细胞周期和介导P53依赖性细胞凋亡，抑制细胞增殖[10-11]。研究显示，LncRNA-P21在食管癌、膀胱癌、直肠癌等多种实体肿瘤中表达下调，发挥抑癌基因作用，LncRNA-P21通过上调P21表达或通过P53非依赖性途径抑制细胞周期蛋白Cyclin D的表达，诱导G1期阻滞，促使食管癌细胞凋亡[12]。LncRNAP21还可通过抑制谷氨酰胺酶和谷氨酰胺分解代谢抑制膀胱癌细胞生长[13]。LncRNA-P21高表达可提高直肠癌对术后放疗的敏感性，延长患者的总生存期[14]。本研究发现LncRNA-P21在三阴性乳腺癌组织中表达下调，LncRNA-P21低表达与Ki-67≥30%、临床Ⅲ期、腋窝淋巴结转移，以及更低的5年DFS和OS生存率有关，提示LncRNA-P21低表达可能促使乳腺癌细胞增殖、侵袭和转移，与三阴性乳腺癌预后不良有关。LncRNA-P21在三阴性乳腺癌的发病机制尚不明确，可能为LncRNA-P21低表达介导癌基因MDM2引发蛋白酶体依赖性降解P53，激活核因子-κB和转录信号转导子和激活子3通路，促使巨噬细胞向促炎性M1表型转化，诱导肿瘤微环境改变，继而促使乳腺癌进展[15]。

miR-17-3p由前体miR-17的3"臂加工而成，可促进细胞增殖和抑制细胞死亡，在细胞增殖分化、凋亡和迁移过程中发挥重要作用[16-17]。miR-17-3p在结肠癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中表达上调，通过靶向抑制Par4表达促使结肠癌细胞存活和增殖[18]，还可通过靶向金属蛋白酶组织抑制剂3诱导前列腺肿瘤细胞生长和侵袭[19]。本研究结果显示，与癌旁组织比较，三阴性乳腺癌组织miR-17-3p表达上调，且miR-17-3p高表达与Ki-67≥ 30%、临床Ⅲ期、有腋窝淋巴结转移有关，表明miR-17-3p过表达可能促使乳腺癌细胞恶性增殖，miR-17-3p在三阴性乳腺癌中可能为致癌基因。本研究结果发现，miR-17-3p高表达与5年DFS和OS低生存率有关，miR-17-3p是乳腺癌患者预后不良的危险因素，提示其与三阴性乳腺癌预后不良有关，可作为乳腺癌预后评估的参考指标。miR-17-3p参与三阴性乳腺癌的机制可能为：miR-17-3p过表达可能下调E-上皮钙黏附素表达，上调波形蛋白表达，促使乳腺癌细胞增殖，增加集落形成数量，增强侵袭和迁移能力[20]，进而促使三阴性乳腺癌病情进展。本研究相关性分析结果显示，LncRNA-P21表达与miR-17-3p表达呈负相关，表明在三阴性乳腺癌发病机制中LncRNA-P21和miR-17-3p可能存在相互调控作用机制。敖翔等[20]也指出LncRNA-P21可负性调控miR-17-3p，LncRNA-P21表达缺失可促使miR-17-3p过表达，进而促使乳腺癌细胞增殖，抑制其凋亡，导致癌细胞的侵袭和迁移。

综上所述，三阴性乳腺癌组织LncRNA-P21表达下调，miR-17-3p表达上调；
LncRNA-P21低表达、miR-17-3p高表达可能与乳腺癌细胞的增殖、侵袭、转移等恶性行为有关，是三阴性乳腺癌预后的影响因素；
LncRNA-P21可能通过负向调控miR-17-3p表达促使三阴性乳腺癌进展。

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