定氮仪-气质联用仪快速测定皮革中19种含氯苯酚

文/王玲霞 孙思武 孙静 刘永亮 毛世南 李梦洁

含氯苯酚可以阻止真菌的生长、抑制细菌的腐蚀作用[1]，被广泛用于皮革杀菌剂和防腐剂[2-3]，含氯苯酚化学性质稳定，残留时间久，可以通过呼吸道、消化道或皮肤吸收进入人体，长期接触后会在体内蓄积，轻则造成皮肤过敏，重则对肝脏和肾脏造成损害，从而对人类的健康产生威胁[4-6]。

由于含氯苯酚具有很强的致癌、致畸和致突变效应，被世界许多国家列入污染物的黑名单[7-9]，严格限制使用。ISO/TR16178:2012[10]和GB/T 29292—2012[11]限制在鞋类和鞋类部件中使用三氯苯酚、四氯苯酚、五氯苯酚[12]，LEATHER STANDARD by OEKO-TEX®限制在生态皮革中使用包含一氯苯酚、二氯苯酚、三氯苯酚、四氯苯酚、五氯苯酚共19种含氯苯酚[13]。

对于含氯苯酚的检测已有大量文献报道[14-19]，目前，皮革中含氯苯酚的检测标准主要有GB/T 22808—2021[20]和ISO 17070：2015[21]，标准规定水蒸气蒸馏提取皮革中的含氯苯酚，用碳酸钾吸收，经乙酸酐乙酰化和液液萃取后，用气质联用仪进行测定，这一方法对于基质复杂的皮革样品来说，虽有基底较为干净、杂质峰较少的优点，但其提取时间长、浪费人力的缺点也是饱受诟病，尤其不适用于检测机构大批量样品的检测分析。因此，建立准确快速检测皮革中含氯苯酚的检测方法具有重要的意义。

本研究建立了定氮仪-气质联用仪快速测定皮革中19种含氯苯酚的方法。用定氮仪代替常规的水蒸气蒸馏方法，来提取皮革中的含氯苯酚，馏出液用碳酸钾吸收，经乙酸酐乙酰化和液液萃取后，用气质联用仪进行测定，实现了皮革中含氯苯酚的快速、准确和批量测定。

1.1 仪器与材料

Agilent7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪（美国，Agilent公司），K9840自动凯氏定氮仪（中国，海能仪器），MMV-1000W垂直振荡器（日本，东京理化）。

标准品：19种含氯苯酚混标，100mg/L，购于阿尔塔科技有限公司，四氯邻甲氧基苯酚（TCG），购于Dr.Ehrenstorfer公司。正己烷、甲醇均为色谱纯，硫酸、三乙胺、乙酸酐、碳酸钾均为分析纯。

1.2 标准溶液的配制

移取0.5mL浓度为100mg/L 19种含氯苯酚混标，用正己烷定容至5mL，得到浓度为10mg/L的中间浓度标准溶液。

标准曲线的配制：分别准确移取50μL、0.25mL、0.5mL、0.75mL中间浓度标准溶液至5mL容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L的标准工作溶液。

移取0.5 mL浓度为0.1 mg/L的标准工作溶液至5mL容量瓶中，用正己烷定容，得到浓度为0.01 mg/L的标准工作溶液。

1.3 仪器分析条件

色谱条件：色谱柱：DB-35（30m×0.25mm×0.25μm），程序升温：80℃（3min），以3℃/min升至150℃（1min），再以10℃/min升至220℃（0min）；
进样量：1μL，不分流；
进样口温度：250℃；
传输线温度：280℃；

质谱条件：电离方式：EI；
载气：氦气；
离子源温度：230℃，四极杆温度：150℃；
扫描范围：50～350；
数据采集模式为全扫描（SCAN）+选择离子监测（SIM），SIM模式的定量离子和定性离子等参数见表1（注文中图表中的数字对应的化合物名称同表1）。

表1 含氯苯酚乙酰化产物的保留时间、定性/定量离子、线性方程和相关系数

1.4 前处理

准确称取1.00g样品置于消化管中，加入25mL 浓度为1mol/L的硫酸，采用自动模式蒸15min，用装有1g碳酸钾的锥形瓶作为接收器收集馏出液。

将馏出液倒入分液漏斗中，加入0.5mL三乙胺、1.5mL乙酸酐、25μL浓度为100mg/L的TCG内标溶液和2mL正己烷，将分液漏斗置于垂直振荡器上振荡反应30min，振荡频率≥300r/min。振荡完成后，静置5min，取上清液，经无水硫酸钠脱水后，进行GC-MS分析。

2.1 前处理的优化

2.1.1 硫酸用量的选择

试验考察了蒸馏时硫酸用量对蒸馏效果的影响，分别加入0mL、1mL、2mL、5mL浓度为1mol/L硫酸于25mL水中与25mL硫酸（1mol/L）蒸馏效果进行对比，结果见图1，结果发现加入25mL硫酸（1mol/L）蒸馏效果最好。从图1可以看出，硫酸用量对萃取效果有显著影响，这是由于硫酸可持续提供强酸环境，并且可破坏皮革表面结构，有利于提高萃取效率，因此，选择加入25mL浓度为1mol/L硫酸溶液用于蒸馏试验。

图1 硫酸用量对含氯苯酚乙酰化产物浓度的影响

2.1.2 蒸馏时间的选择

试验考察了蒸馏时间对蒸馏效果的影响，试验了蒸馏5min、10min和15min对蒸馏效果的影响，结果发现短时间蒸馏对一氯苯酚的蒸馏效果较好，长时间蒸馏五氯苯酚的蒸馏效果较好，15min时综合蒸馏效果较好，因此，选择蒸馏15min。

图2 蒸馏时间对含氯苯酚乙酰化产物浓度的影响

2.1.3 碳酸钾用量的选择

试验考察了用于吸收馏出液的碳酸钾用量对蒸馏效果的影响，试验了1g、2g和3g对蒸馏效果的影响，结果发现用1g碳酸钾时整体蒸馏效果较好，这是由于蒸馏产物难溶于水，而无水碳酸钾可与蒸馏产物反应成钾盐，可稳定存在于馏出液中，因此，选用1g碳酸钾来吸收馏出液。

图3 碳酸钾用量对含氯苯酚乙酰化产物浓度的影响

2.1.4 色谱柱选择

本研究采用了DB-5MS和DB-35MS两种色谱柱对19种含氯苯酚乙酸酯进行测定。结果发现：两种色谱柱对大多数含氯苯酚乙酰化产物具有较好的分离效果，对2,4-二氯苯酚和2,5-二氯苯酚乙酰化产物均无法分离，但DB-5MS对3-氯苯酚和4-氯苯酚乙酰化产物分离度不好，峰形较差。因此选用DB-35MS色谱柱，后续对升温程序进行优化，也难以将2,4-二氯苯酚和2,5-二氯苯酚乙酰化产物分离。在优化的试验条件下，含氯苯酚及内标物乙酰化产物的出峰顺序和保留时间如图4所示。

图4 含氯苯酚及内标物乙酰化产物的SIM色谱图

2.2 方法验证

2.2.1 线性与检出限

按照仪器条件对19种含氯苯酚乙酰化产物进行测定，以含氯苯酚与内标物乙酰化产物浓度比为横坐标，二者的峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线，当含氯苯酚质量浓度在0.01mg/L～1.5mg/L范围时，线性关系良好，详见表1。

按照试验方法对6个加标量为0.05mg/kg的空白皮革样品进行测定，以10倍标准偏差计算检出限，结果见表1。

2.2.2 精密度与回收率

以空白皮革样品为基质，分别添加0.01mL、0.02mL和0.1mL浓度为10mg/L的19种含氯苯酚混标，理论检出浓度分别为0.05mg/L、0.1mg/L和0.5mg/L，每个浓度水平制备6个平行样，按试验方法进行测试，计算回收率和相对标准偏差（RSD），精密度和回收率试验结果见表2。

表2 19种含氯苯酚乙酰化产物不同浓度水平的加标回收率

由表2可知，19种含氯苯酚的回收率为85.0%～105.0%，说明该方法准确可靠；
RSD为0.9%～9.9%，表明方法精密度较好。

2.3 样品检测

应用本方法对20个送检皮革样品进行检测，在2个样品中检出2,4,6-三氯苯酚，含量分别为1.2mg/kg和6.9mg/kg，其他种类含氯苯酚未检出。

本文基于定氮仪的蒸馏方式，建立了皮革中19种含氯苯酚的气相色谱-质谱法测定方法。试验证明该方法具有提取效率高、准确度高、精密度好等特点，为皮革中含氯苯酚化合物的高效测定提供了借鉴。

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